结核分枝杆菌联合药敏试验的研究进展

张琳琳 杨华 肖和平



·综述·

结核分枝杆菌联合药敏试验的研究进展

张琳琳 杨华 肖和平

结核病仍然是威胁全球性的传染病，随着耐多药和广泛耐药结核分枝杆菌的出现，结核病的控制变得更加困难。为了防止结核分枝杆菌对某种药物耐药，WHO推荐结核病的治疗以几种不同的药物联合治疗为主。对于耐药结核病的治疗应根据药敏结果采取个体化治疗方案。目前的药敏试验大都是针对单药进行的，但是有时即使单药药敏试验结果是耐药，临床中与其他药物联合使用仍有较好的治疗效果，这提醒我们几种药物联合使用可能会增强其抗菌活性。当前存在一线药物耐药问题严重以及二线药物价格昂贵、毒性大等问题，因此迫切需要我们寻找新的抗结核化疗方案来控制耐药结核病的流行。在建立新的化学方案前，进行可量化的重复实验来评估方案中几种药物的联合抗菌活性是十分重要的。

结核分枝杆菌； 微生物敏感性试验

为了防止结核分枝杆菌耐药的发生，WHO一直推荐抗结核药物的联合治疗。药物敏感性试验(简称“药敏试验”)是检测耐药与否的最有效方法，临床医生可以根据药敏试验结果制订更趋于合理的抗结核化学治疗(简称“化疗”)方案。但是目前的药敏试验主要是针对单药检测而设计的，对于评估化疗方案的效果尚存缺陷。具体表现在单药耐药并不意味着化疗方案无效，仍有可能获得较好的治疗效果，这可能与抗结核药物的协同作用有关；方案中所有药物均敏感也不代表治疗效果一定很好，这则可能系联合药物间的拮抗作用所致。因此，建立可量化的重复实验评估化疗方案中药物的联合抗菌活性是十分重要的[1]；联合药敏试验可望解决这一重要需求。联合药敏试验的实验方法是在国际临床实验室标准委员会制定的肉汤稀释法的基础上提出的，能够在特定时间内评估药物联合作用时的抑菌或杀菌活性[2]。

微生物学家通常使用棋盘法来评估几种药物的联合效应，而肉汤稀释法、琼脂稀释法或药敏纸片扩散法也可以用来评估药物的联合效应[2]。棋盘法可以对几种药物联合效应进行体外评估并指导临床用药，包括微量棋盘稀释法、试管棋盘稀释法(大量稀释法)和琼脂棋盘稀释法3种，其中微量棋盘稀释法为最常用的联合药敏试验方法[2]。微量棋盘稀释法常使用96孔无菌微孔板，每种药物最高从2倍最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)开始倍比稀释，一般取6～8个稀释度[3]，通过计算部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration，FIC)，判断药物之间的相互作用。2种药物联合药敏试验的FIC值计算为：FIC=联合MIC[A]/单药MIC[A]+联合MIC[B]/单药MIC[B], FIC指数≤0.50定义为协同，0.50～4.00定义为相加与无关，>4.00定义为拮抗[2]。3种药物联合药敏试验的FIC值计算为：FIC=联合MIC[A]/单药MIC[A]+联合MIC[B]/单药MIC[B]+联合MIC[C]/单药MIC[C]，FIC指数≤0.75定义为协同，0.75～4.00定义为相加与无关，>4.00定义为拮抗(A、B、C分别代表3种不同的抗结核药物)[4]。联合药敏试验可适用于以下几种情况：(1)对药物之间的协同作用不清楚；(2)新的化疗方案；(3)由于细菌的耐药或治疗失败而对药物协同性不能确定[2]。本研究主要对联合药敏试验在细菌耐药性检测、尤其是结核分枝杆菌药敏检测中的研究进展做一综述。

一、联合药敏试验在细菌药敏检测中的应用

联合药敏试验中最常使用的是微量棋盘稀释法，用来检测联合用药对各种耐药菌(如耐药金黄色葡萄球菌和耐药淋球菌等)的体外效应，并指导临床用药。

早在1974年，人们使用棋盘琼脂稀释法测定新诺明、甲氧氨苄嘧啶、多黏菌素B每2种药物联合时及3种药物联合时对不同的革兰阴性杆菌的联合效应[5]。结果表明，甲氧氨苄嘧啶-多黏菌素的协同作用要优于其他的组合用药，3种药联合作用时抗菌效果还会增加。这一研究为临床治疗革兰阴性杆菌引起的难治性感染性疾病提供了用药依据，而且为以后的研究做了铺垫。

1978年，Berenbaum[6]指出二维棋盘法测定2种药物的协同性是可行的，但是测定3种较困难，对4种及以上均不可行。因此在二维棋盘法的基础上首次提出三维棋盘法的理论操作程序。1980年，Yu等[7]使用三维棋盘法对假单胞菌进行实验，发现庆大霉素-羧苄青霉素-利福平联合使用时的平均的部分抑菌浓度指数为0.32，甲氧氨苄嘧啶-羧苄青霉素-利福平联合使用时的平均的部分抑菌浓度指数为0.18，对14种临床假单胞菌株的试验均证实3种药物之间具有协同作用。1980年，Yoon等[8]也使用三维棋盘法对鲍曼不动杆菌进行研究，发现多黏菌素-亚胺培南-利福平联合使用具有协同杀菌效果。这是三维棋盘法首次在普通细菌耐药性检测中的应用，并通过数据分析证明多药联合可增加杀菌效果。

2012年，Cetin等[9]使用棋盘法和浓度梯度法2种方法测定多黏菌素B、利福平分别与氨苄青霉素-舒巴坦或头孢哌酮-舒巴坦联合作用时抗耐多药鲍曼不动杆菌的联合效应。该研究表明，利福平+氨苄青霉素-舒巴坦的协同性在使用棋盘法时表现为最好，浓度梯度法检测结果更多地表现出不相关性。该研究结果与之前发表的关于这2种方法协同性的研究结果相比差异没有明显统计学意义。虽然棋盘法为判断联合药敏抗菌活性的标准方法，但是浓度梯度法的操作方法简单、且节省人力，有可能替代棋盘法成为标准方法。但实际上，2种方法检测协同性的结果不是高度一致，因此在临床应用中有必要将体外检测结果结合药代动力学和药效学的数据综合考虑。浓度梯度法与棋盘法的检测结果相比仍有一定差距，因此还不能作为一种标准的联合药敏试验方法替代棋盘法。

由于抗生素的不规则使用导致耐药菌的增多，单一药物控制耐药菌的能力有限，为了更好地控制感染并防止耐药菌进一步的发展，联合药敏试验应作为一种指导临床用药的有效手段进行推广。然而，棋盘法作为标准的联合药敏方法，操作繁琐，耗费的人力物力均较大，对于普遍开展还存在一定的困难，尽管其他的联合药敏方法也在应运而生，但其检测效果与棋盘法存在一定差距，仍不能替代棋盘法作为一种标准的检测方法，迫切需要进一步研究。

二、联合药敏检测在结核分枝杆菌药敏检测中的应用

棋盘法作为检测耐药菌联合效应的标准方法，也适用于对耐药结核分枝杆菌进行联合药敏试验检测。这种方法对指导耐药结核病的治疗起到了一定作用。近些年来，人们使用棋盘法检测耐药结核分枝杆菌联合药敏试验越来越多，并获得了较好的研究成果。

1992年，Moody[2]提出使用二维棋盘法对2种混合抗结核药物的抗菌活性加以研究，以哌拉西林和阿米卡星为例，对二维棋盘法评估2种药物联合效应的操作方法及注意事项作了详细介绍。二维棋盘法包括微量稀释法和大量稀释法，但是后者的准备工作特别繁琐，实际工作中并不推荐使用。评价抗结核药物之间的协同性与其他抗生素一样，也是以部分抑菌浓度指数(FIC)的大小来评估，通过计算各种浓度作用时2种药物的FIC值；根据FIC值的大小，还可得出2种药物作用的最佳浓度[2]。

1995年，Cavalieri等[10]使用Bactec 460 TB系统检测克拉霉素与抗结核药物(异烟肼、利福平、乙胺丁醇)混合使用时的联合抗菌活性，该实验选取12株耐药结核分枝杆菌菌株,对各种药物在0.5～2.0 μg/ml的各种混合浓度进行研究。结果表明克拉霉素与抗结核药物混合使用时的FIC值均在0.23～0.50之间，即克拉霉素与抗结核药物联合使用时具有协同作用。因此克拉霉素与抗结核药物联合使用可能是一种抗耐药结核病的有效治疗方案。

1998年，Bergmann等[11]使用大量稀释棋盘法评估利福平和其他4种药物(异烟肼、阿米卡星、司帕沙星和克拉霉素)中任一种联合使用的抗结核活性，通过计算FIC值评估2种药物之间是否具有协同作用。该研究分别选取5株结核分枝杆菌敏感菌株和5株耐药菌株(至少耐异烟肼和利福平)，使用Bactec 460 TB系统来进行研究。研究结果显示，2种药物联合使用对敏感菌均表现为协同或不相关，对耐药菌因菌株不同和联合的药物不同而表现为协同、不相关或拮抗。因此,利福平无论与异烟肼还是与二线抗结核药物联合使用,是否具有协同性均取决于联合的药物及所研究的菌株。任何一组联合药物都不会对所有的结核分枝杆菌菌株都表现为协同作用。

2005年，Bhusal等[12]用三维棋盘法对10株结核分枝杆菌菌株进行研究，检测28种抗结核药物分别与异烟肼和利福平联合使用时的杀菌活性。该实验是在二维棋盘法的基础上进行，将异烟肼和利福平以文献[2]所述的二维棋盘法操作方法加入96孔微孔板，再将第三种药物的某一浓度加入二维棋盘法的每个孔中，每块微孔板中只加入一种浓度，第三种药物的浓度分别为其MIC值的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32和0。该研究显示氟喹诺酮类药物及其他抗结核药物(克拉霉素)与异烟肼和利福平联合作用时的抗菌效果较好，为二线抗结核药物的选择及使用提供了依据。同时该研究表明异烟肼和利福平联合作用时，FIC值在0.94～1.19之间，表明2种药物之间既无协同作用，也无拮抗作用，表现为不相关作用。

2012年，Rey-Jurado等[13]使用三维棋盘法对比标准方案中3种药物异烟肼-利福平-乙胺丁醇或者氧氟沙星-利福平-乙胺丁醇2种方案的抗结核活性。该研究选取11株敏感菌株和12株耐药菌株(耐异烟肼和链霉素)，每种药物选取5个浓度，高于MIC值、等于MIC值及分别倍比稀释MIC值3次的浓度。结果表明，异烟肼-利福平-乙胺丁醇在耐异烟肼菌株表现为协同作用，在对异烟肼敏感的菌株却不表现协同作用。氧氟沙星-利福平-乙胺丁醇组合方案在对异烟肼敏感和耐药的菌株均表现出协同作用。该研究表明，3种药联合方案对耐药菌均可表现为协同作用，而且含氧氟沙星的方案表现出更好的协同效果，进一步提示体外评估3种药物的联合抗菌活性对于确定新的抗结核方案与评价新药的联合抗菌活性是非常重要的。

2013年，Caleffi-Ferracioli 等[14]为评估氟喹诺酮类药物与常规抗结核药物联合使用的抑菌效果，对20株结核分枝杆菌(9株敏感、10株耐药和标准株H37Rv)在体外进行联合药敏检测，分别使用经典二维棋盘法及在二维棋盘法基础上使用偶氮间苯四酚(resazurin)作为指示剂的方法来判断结核分枝杆菌的生长情况。2种方法均显示乙胺丁醇与左氧氟沙星联合作用时具有协同作用，异烟肼与左氧氟沙星联合作用时没有协同性。通过统计分析证明两种方法之间差异没有统计学意义，但是由于比色法操作简单，对设备及操作人员的要求低，因此这种方法受到越来越多的重视。

2013年，Rey-Jurado等[4]使用三维棋盘法对结核分枝杆菌敏感株和耐药株进行研究，检测利奈唑胺-左氧氟沙星-阿米卡星、利奈唑胺-左氧氟沙星-乙胺丁醇及左氧氟沙星-阿米卡星-乙胺丁醇3种方案的抑菌或杀菌活性，并比较这3种方案的抗菌效果与一线抗结核方案异烟肼-利福平-乙胺丁醇抗结核分枝杆菌敏感株的效果。结果显示任何3种药物联合作用时的FIC值均在1.5～3.0之间，即任何3种方案各药物之间都没有相关性。且二线抗结核方案和一线抗结核方案显示同样的结果。

联合药敏试验研究抗结核药物的联合抗菌活性已经历了20多年的时间，科学家们克服了许多难题，使联合药敏试验的操作方法趋于简单，评估效果趋于准确，并研究了多种联合药敏方法，为临床提供了各种可靠数据，如新的组合方案及新药的开发等。但是棋盘法对于敏感结核分枝杆菌的研究较多的表现为不相关性，对耐药结核分枝杆菌的研究可表现为协同作用或拮抗作用。棋盘法可作为一种标准的联合药敏方法评估抗结核药物联合使用时的协同性大小，并为临床抗耐药结核病药物的选择提供依据，但仍需要进一步完善。

三、存在的问题及展望

近几十年来WHO推荐几种抗结核药物联合使用，可更有效的治疗结核病[14]。目前虽然新的抗结核药物的研发是非常有必要的，但是很少有药物进入到临床研发阶段[15]。对抗结核药物进行体外药敏检测是制定抗结核方案的第一步[4]。尽管临床上存在不同的抗结核药物联合使用，但是尚无抗结核药物的体外联合效应的研究，而这种效应可通过联合药敏棋盘法来研究[4]。联合药敏棋盘法提供了可量化及可重复的实验结果，用来评估抗结核化疗方案包括二线抗结核药物组合方案及新开发药物组合方案的联合抗菌活性，为结核病尤其是耐药结核病的治疗提供理论依据，从而有助于控制结核病的流行。然而，由于联合药敏试验中交叉药敏浓度的配制次数是成指数增加的，目前多数体外联合药敏的研究只包含2种抗结核药物，3种或3种以上药物联合药敏实验的研究报道相对较少[16-19]。由于抗结核化疗方案一般包括至少3种药物，因此，包含3种药物的联合药敏试验方法更为实用[4]，急需进一步研究。

棋盘法通过计算FIC值的大小判断药物之间的协同性，可为联合用药的抗菌活性检测提供准确的结果，已成为联合药敏试验的金标准[20]，可为抗结核化疗方案的制定提供实验室依据。但由于结核分枝杆菌体外生长需时较长，所以该方法相对复杂、费时，研发新的针对结核分枝杆菌的联合药敏试验检测方法成为迫切需要解决的问题[21]。此外，棋盘法已经对于标准抗结核方案中异烟肼、利福平、乙胺丁醇的联合作用已被研究，来判断标准方案中除了吡嗪酰胺之外的3种药物之间的联合效应。吡嗪酰胺未被研究是由于其在体外呈酸性[22]。

综上所述，联合药敏试验主要用于评判抗普通耐药菌药物及抗耐药结核分枝杆菌药物之间的协同作用，从而指导临床用药方案的选择。该方法在普通细菌感染以及结核病尤其是耐药结核病联合药敏检测方面已取得了一定的成就，对于临床选药也起到一定的作用，但是操作方法繁琐，评估方法复杂，导致对于联合效用的评估存在一定误差，因此还需要更进一步完善，在动物模型和临床实践中的评估和应用也需要尽快开展，以验证其可信度，真正实现其指导临床用药的应用价值。

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(本文编辑：王然 薛爱华)

The progress of combined drug susceptibility test withMycobacteriumtuberculosis

ZHANG Lin-lin*, YANG Hua, XIAO He-ping.

*The Department of Clinical Medicine, School of Medicine, Suzhou University, Jiangsu 215123,China

Corresponding author: XIAO He-ping, Email: xiaoheping_sars@163.com

Tuberculosis remains a threat to global pandemic, it becomes more difficult to control TB due to the emergence of multidrug-resistant and extensively drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Preventing the resis-tance to a paticular drug, WHO has recommended the combined modality therapy with several drugs as the main method in the treatment of TB. Individualized treatment plan, based on the drug susceptibility results, should be taken in the treatment of drug-resistant TB. So far, the drug susceptibility test is mostly carried out for monotherapy. However, in some cases, even the single drug susceptibility results are resistant, the combined modality therapy still performances better therapeutic effect,which reminds us that the combination of several drugs used in treatment may enhance its antibacterial activity. At present, because of the severe drug resistance of first-line drugs and the shortcoming of second-line drugs (such as price，toxicity and so on), we urgently need to find a new anti-TB chemotherapy to control the prevalence of drug-resistant. Before creating a new chemistry program, it is important to conduct quantified experiments repeatedly to evaluate the antimicrobial activity of the combined modality therapy.

Mycobacterium tuberculosis； Microbial sensitivity tests

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.01.016

“十二五”国家科技重大专项(2013ZX10003009)

215123 苏州大学医学院临床医学系(张琳琳)；上海市结核病(肺)重点实验室 同济大学附属上海市肺科医院结核科(杨华、肖和平)

肖和平，Email:xiaoheping_sars@163.com

2014-11-19)