Src/VE-cadherin信号通路在创面愈合中的研究进展

高家治 施 展 王建东 田 亮

·综 述·

Src/VE-cadherin信号通路在创面愈合中的研究进展

高家治 施 展 王建东 田 亮

Src；VE-cadherin；信号通路；创面愈合；研究进展

创面愈合包括连续而又相互重叠的3个阶段，即炎症期、肉芽组织形成期和瘢痕形成期。早期炎症期主要由单核、巨噬细胞和中性粒细胞等向伤处迁移并释放多种细胞因子。中期由成纤维细胞和新生毛细血管等形成肉芽组织，填补组织缺损，并由表皮细胞增殖、迁移重建上皮屏障。后期则主要由成纤维细胞分泌并沉积基质。目前研究认为[1]，生长因子参与调控创面愈合的全过程。生长因子通过与细胞膜上特定的高亲和性受体结合而启动其活性，然后通过信号通路而发挥作用。信号通路是创伤愈合修复研究中探索外界因素与内在因素联系的关键[2]。

1 Src蛋白

1.1 Src蛋白家族结构 Src蛋白家族是具有酪氨酸蛋白激酶（protein tyrosine kinase，PTK）活性的蛋白质，目前发现由13个成员组成，在人的基因中有11种，分别是：Blk、Brk、Fgr、Frk、Fyn、Hck、Lck、Lyn、Src、Srm和Yes，其中Src蛋白是目前研究最多的成员，Src广泛存在于组织细胞中，通过信号通路中重要分子的相互作用，作为连接许多细胞外和细胞内重要信号途径的结合分子，Src在受体介导的信号途径中具有中心调节作用。所有的Src家族成员都由几个特殊结构域组成，其结构从N—端开始依次是SH4结构域、Unique结构域、SH3结构域、SH2结构域及SH2激酶连接子蛋白-酪氨酸激酶结构域（SH1结构域），最后为具一保守酪氨酸磷酸化位点的C—端调节域[3]。

1.2 Src蛋白激酶活性调节 Src蛋白由不同功能的结构域组成，位于N-端的SH4区包含了豆蔻酰化和蛋白质棕榈化的位点，这些位点的改变可使Src蛋白锚定于细胞膜的内表面，Unique结构域包含蛋白激酶C绑定位点-Ser12和Ser48-在细胞中PKC激活的过程中被磷酸化[4]。随后的SH3区具有与富含脯氨酸序列的基质蛋白结合的特性，位于SH3之后的SH2的结构域通过C-端磷酸化Tyr527的结合参与调控激酶本身活性的抑制，作为Src蛋白催化区域的SH1是一个双裂结构，ATP通过与铰链区结合发生自身磷酸化，触发激酶的活性，位于SH1结构域之后的C-端区域包含Tyr527调控残基，此残基的磷酸化和去磷酸化可调节Src激酶的活性。Src中两个最重要的调节磷酸化位点中的一个是Tyr527，C末端的六个残基。在体内的基本条件下，90～95%的Src是在Tyr527上磷酸化的[5]。磷酸酪氨酸527分子内连接SrcSH2结构域。这种分子内连接形式固定酶的限制形式[6]。在限制酶中，既不是SH2也不是SH3接近外来配体。Tyr527Phe突变物比野生型酶更活跃并且能诱导体外的锚定—依赖生长和体内肿瘤[7-8]。Tyr527磷酸化产生是由于其他蛋白—酪氨酸激酶的活动包括Csk和Chk[9]。Sre经历在酪氨酸416上的细胞内自动磷酸化，这个残基存在于激活环中，它的磷酸化促进激酶活动[10]。

SH2区及SH3区在Src家族激酶的催化活性调节中起关键作用，X射线衍射分析显示，细胞内SH2和SH3区间相互作用是怎样稳定Src激酶非活性结构的。两个区都靠近激酶区，从一边朝向对面的催化区裂口。SH3区与催化区作用并连接着SH2区与催化区间的序列[11]，Tyr527去磷酸化将导致Src催化活性的激活[12]。Src激酶通过复杂的分子内相互作用而处于抑制状态，使其活性可受多种膜结合受体及剪切蛋白调节，如Src激酶的PTK活性可被含磷酸化酪氨酸的蛋白激活，再如Src激酶也可被蛋白酪氨酸磷酸酶活化。Src激酶一旦解除了抑制状态，PTK功能域内一个关键酪氨酸残基就被磷酸化，其PTK活性从而被激活。Src的这种“关闭”与“开放”结构通过膜脂修饰与细胞膜相连，使其能稳定地被细胞膜上启动的各种信号激活并发生相互作用，如Src激酶可被许多细胞膜受体激活。

2 VE-cadherin蛋白

2.1 VE-cadherin蛋白结构 血管内皮钙黏附素（vascular endothelial Catherin，VE-cadherin）是血管内皮细胞表面特异的跨膜黏附蛋白。钙黏蛋白是黏附分子家族一种，具有Ca2+介导的亲同源性连接功能。主要分为两型，Ⅰ型钙黏蛋白仅在上皮细胞的黏附连接中发现，包括E-cadherin、N-cadherin、P-cadherin、C-cadherin，Ⅱ型钙黏蛋白胞外区EC1区缺乏HAV基序［组-丙-缬（His-Ala-Val）即HAV三肽序列结构］。VE-cadherin在血管内皮细胞的黏附连接处发现[13]，属于Ⅱ型钙黏蛋白。VE-cadherin分子量约为130～140kda，是由780个氨基酸组成的单链糖蛋白，由胞外区、跨膜区和胞浆区三部分组成。胞外区含110个氨基酸，由5个同源重复结构域和Ca2+结合序列组成，可介导钙依赖的细胞与细胞黏附；胞浆区通过胞内介导蛋白与细胞骨架相连。

2.2 VE-cadherin蛋白分类及功能 VE-Cadherin（又Ncadherin-5、784或CD-1441）是特异表达于内皮细胞的钙黏附素[14]。它介导相邻内皮细胞之间的黏附连接，在保持血管的完整性，调节内皮细胞之间的通透性，白细胞外渗以及细胞内的信号传导中发挥重要作用；VE-cadherin除了黏附特性之外，还参与调节各种细胞内进程，比如细胞增殖、细胞凋亡和调节血管内皮生长因子受体的功能，因此，VE-cadherin对于创面修复过程中血管形成和血管新生是必需的。VE-cadherin有VE-cadherin-1和VE-cadherin-2两种亚型，其中VE-cadherin-1与几种骨架蛋白（如p120、β-连环蛋白和盘状球蛋白）相连控制着内皮细胞与内皮细胞之间连接的稳定性，细胞间隙的通透性、细胞分散、血管形成和细胞内的信号传导[15]。VE-cadherin-2是最近在血管内皮细胞（vascularendothelial cell，VEC）表面新发现的一种钙黏蛋白，它表达黏附特性，但不与细胞骨架蛋白连环蛋白（catenin）连接，也不参与调节细胞间隙的通透性以及细胞的迁移和生长。

3 Src/VE-cadherin信号通路在创面愈合的作用

创面的愈合过程包括凝血、炎症反应、基质合成与沉积、血管生成、纤维组织形成、上皮化、创面收缩及重塑。炎症反应是创面愈合的首要步骤，并且伤口愈合过程中，炎症伴随始终。适度炎症促进愈合，过度炎症破坏愈合[16-17]。炎症不仅影响愈合，也是伤口不适症状的主要原因。近期国外学者的工作提示[18-21]，血管通透性在调节炎症渗出和促进愈合两方面都起到重要作用，血管通透性和毛细血管内皮细胞之间的紧密连接、内皮细胞层的连续性、毛细血管基底层完整性等因素有关，其中最重要的是内皮细胞之间的紧密连接。而VE-cadherin是血管内皮细胞黏附连接的主要成分，受Src的调控。因此由Src调控的Src/VE-cadherin信号通路可通过调节血管通透性促进创面愈合。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth fator，VEGF）可诱导引起β-catenin与VE-cadherin结合位点的半胱氨酸619（Cys619）S-亚硝基化而增加血管的通透性。阻止内皮型一氧化氮合酶eNOS相关的NO引起β-catenin的Cys619的S-亚硝基化能阻止β-catenin与VE的分离和黏附复合物的分解，阻止VEGF刺激的血管通透性的增加[22]。白细胞可经跨细胞通道转运途径，穿过内皮细胞层，但主要是内皮细胞间连接开放让白细胞通过。通过视频显微镜、VE-cadherin-GFP（绿色荧光蛋白）转染内皮细胞或抗体标记VE-cadherin和血小板内皮细胞黏附分子1（PECAM-1）方法证实，在单核细胞通过内皮细胞的局部，VE-cadherin-catenin复合物染色显示丢失。因此，推测VE-cadherin如窗帘一样移到一边或者是通过内吞作用减少局部VE的浓度减弱内皮细胞的连接让白细胞通过。VE-cadherin对酶的溶解十分敏感。金属蛋白酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶G或最小浓度的胰蛋白酶能诱导VE-cadherin胞外区域的消化分解，而中性粒细胞和肿瘤细胞能释放大量的这些酶，因而能促进VE-cadherin的分解，增加细胞的溢出和脉管系统的渗漏[23-24]，增加对白蛋白的通透性。通过调节血管渗透性，控制炎症反应，促进创面愈合。

Dejana等[25]实验表明，VEGF可激活鸟内皮细胞Src；VEGF介导的血管发生可被编码Src-251的反义核酸所抑制；在鸟血管中过表达Src-251可使其凋亡。揭示VEGF激活Src对于内皮细胞存活和血管发生是必需的。在以小鼠为模型的研究中[26]，用含CSK（一种磷酸化Src抑制位点Tyr527而抑制Src活性的PTK）的逆转录病毒载体处理动物也得到了相似的结果。尽管Src小鼠在VEGF刺激下也有血管发生，但同时缺失Src和Yes却不出现VEGF引起的血管渗透性增加。单独缺失Src并不影响VEGF引起的血管发生，但同时缺失Src、Yes引发胚胎9.5日致死，缺失VEGFR亦引起相同发阶段胚胎致死。酪氨酸激酶Src可能与黏附连接蛋白的磷酸化有关，因为它直接与VE-Cadherin/catenin复合物相关联并且Src基因失活或者抑制剂阻碍血管内皮生长因子引起VE-Cadherin磷酸化调节血管通透性，除此之外还包括CSK，它与磷酸化的VE-Cadherin绑定并且抑制Src的活性[12]，PYK2也可能在VE-Cadherin/ catenin复合物的磷酸化起重要作用，尽管PYK2是否是直接把VE-Cadherin作为酶底物还不清楚，但是它能够直接磷酸化β-catenin[13]，VE-Cadherin也能被磷酸化通过抑制与黏附连接关联的磷酸酶，磷酸酶VE-PTP，因为它是内皮细胞特异性和与VECadherin关联而尤其受到关注。VE-PTP基因的灭活导致VE-Cadherin零表达的胚胎表型，这些研究表明如果VE-Cadherin不断的磷酸化，就不能准确地构建新生血管[14]，创面难以愈合。

细胞增殖、血管形成也是创面愈合的关键一步。VE-cadherin在调节血管形成中同样发挥重要作用。新生血管形成过程中内皮细胞从血管单层内皮脱落，侵入基底组织，形成管道样结构并分枝形成更广泛的血管网。这一复杂过程除了内皮细胞增殖迁移，基质蛋白水解重塑等步骤外，细胞之间及细胞与基质间的黏附也有着至关重要的作用。在血管生成的最早期阶段，细胞连接变得松弛，细胞得以迁移侵入基底组织。VE-cadherin具有限制内皮细胞迁移，调节生长等功能，所以需要以VE-cadherin分子失活为前提，细胞黏附力降低，内皮细胞才能从邻近细胞脱离出来。

4 展望

Src/VE-cadherin信号通路是具有多生物学效性的细胞信号转导途径，在调节血管通透性、控制炎症反应、促进新生血管形成等方面起着重要作用。VE-cadherin通过黏附特性和信号特点，精确地维持内皮细胞间连接的可塑性和完整性的平衡。正是这一条件，使得内皮细胞可以对炎症因子和细胞生长因子的刺激做出动态反应从而保持血管屏障功能。

通过对Src/VE-cadherin信号通路在创面愈合中的作用研究的回顾，控制生长因子效应的最佳途径之一就是阻断它们的细胞内信号转导，所以Src介导的作用越来越得到认可。尽管有关Src蛋白的研究获得了突破性的进展，但仍有许多问题悬而未决。有关不同Src的分子结构和功能、Src的表达与代谢、Src/VE-cadherin信号通路与其他细胞内通路的关系等，尚有大量工作有待进一步探讨。不同信号转导通路都不过是细胞整个信号转导网络的一部分，随着Src蛋白通路研究的深入，人们对VE-cadherin对多种细胞的多功能作用、VE-cadherin与其它多种细胞因子的相互作用等必将有新的认识。有目的地调控和干预Src/VE-cadherin信号通路，将有助于加深对创伤愈合理解和认识，为减轻瘢痕形成，预防纤维化疾病和肿瘤的发生等提供新的治疗方法。

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（收稿：2015-01-20 修回：2015-03-25）

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