急性呼吸窘迫综合征患者肺泡灌洗液蛋白组学研究进展

急性呼吸窘迫综合征患者肺泡灌洗液蛋白组学研究进展

任珊1，2席修明1

作者单位： 100000 北京，首都医科大学附属复兴医院重症医学科1

050051 河北省人民医院重症医学科2

【关键词】急性呼吸窘迫综合征；肺泡灌洗液；蛋白组学

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是以严重感染、创伤、休克等多种肺内外危险因素导致的以肺泡毛细血管损伤为主要病理特征，以非心源性肺水肿和顽固性低氧血症为主要临床表现的疾病。尽管现有的医疗救助水平已有明显提高，但从原始的ARDSnet研究起，ARDS的发生率和总体病死率实质上没有变化，成人病死率仍在40%以上[1-3]。ARDS往往是多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)中最先出现的器官损害，而MODS作为ARDS最严重并发症，它的发生将意味着需要更加密集和高昂医疗的投入，其严重的并发症和高病死率对各国医疗事业来说，都是一个沉重的负担。

一、ARDS柏林定义

1994年欧美共识会议(The American-European Consensus Conference, AECC)提出的ARDS诊断标准一直被沿用多年。这一诊断指标相对简单易行，但是其中的一些定义比较模糊，需要人为判断(如对胸片的判读)，缺乏客观性，同时易受其他因素干扰(如氧合指数能体现疾病严重程度，同时受到吸入氧浓度和呼气末正压的影响)，因此，应用这个诊断标准无法及时、有效和准确的对疾病进行诊断[4-5]。2012年提出“ARDS柏林定义”，内容为[6]: (1) 1周内明确的危险因素后新出现呼吸系统症状或呼吸系统症状明显加重；(2)胸部影像(胸部X 线片或CT) 显示用渗出、肺部结节、肺叶或肺段不张不能完全解释的双侧肺部浸润阴影；(3)不能用心力衰竭或液体超负荷来解释呼吸衰竭，没有危险因素情况时，需使用超声心动图等客观依据来排除静水压增高引起的呼吸衰竭；(4)根据呼气末正压≥5 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)时的PaO2/FiO2，将ARDS分为：轻度、中度和重度3个严重程度级别，即轻度ARDS：200 mmHg

目前，ARDS的发病机制可能与肺内炎症级联反应的启动、肺内凝血和纤溶系统的紊乱、肺泡和毛细血管内皮的损伤等多种机制有关，这些机制的相互作用、相关蛋白的相互作用网络、发病的关键机理和ARDS早期识别的特异性生物学标志物都不甚清楚。生物学功能最终是由蛋白质直接实现的，蛋白组学研究已成为组学时代的重要组成部分，Walter等[7]提出：未来基因组学和蛋白组学的快速发展将对ARDS做出更大的贡献。尽管对ARDS发病机制的理解不断加深，对于预测ARDS进展和危险分层仍然是有限的，生物学标志物能够有助于识别发生ARDS的风险性、评估疗效、预测预后、优化临床试验入选标准，为人类疾病研究提供新的手段和依据。蛋白组学方法能够为研究者提供ARDS中蛋白质定位、修饰、相互作用及功能，在ARDS的蛋白网络中许多高度联系的结点蛋白并没有深入研究，蛋白组学技术可能是发现新的生物学标志物的重要方法。

二、ARDS蛋白组学研究进展

蛋白组学技术在危重症领域的应用逐渐广泛深入，目前多项临床与基础研究关于ARDS与正常血浆或肺泡灌洗液有多种差异蛋白表达，还有针对ARDS发病的不同时期及不同预后的比较。

1. 临床研究：在ARDS发病过程中(1 d、3 d、7 d)对肺泡灌洗液蛋白表达进行分析，应用定量电泳技术找到37种差异蛋白，基因富集分析显示这些差异蛋白主要是炎症、感染及损伤蛋白，网络分析准确预测出ARDS发病机制中的重要介质，如：肿瘤坏死因子α、白介素1β、白介素6、脂多糖结合蛋白、p38丝裂原活化蛋白激酶等。这些蛋白在ARDS中相互作用，为疾病发病机制和预后评估提供新思路[8]。

Poon等[9]应用蛋白组学方法分析严重ARDS患者预后因素，经western blot验证后确认血清血小板因子4(platelet factor 4, PF4)下降和β血小板球蛋白(β-thromboglobulin, β-TG)升高提示预后差，在ARDS病情进展中起指导和预测风险分级、治疗决策等作用。

急性肺损伤(acute lung injury, ALI)引起的呼吸机相关性肺炎(ventilator-associated pneumonia, VAP)患者肺泡灌洗液差异蛋白比较，在ALI组中有无VAP组间发现76种差异蛋白表达，对这些蛋白进行功能学分析提示VAP促炎途径激活，Nguyen等[10]鉴定并验证了其中三种蛋白：S100A8, 乳铁蛋白(lactotransferrin, LTF)、辅肌动蛋白 1 (actinin 1, ACTN1)在肺损伤发生和VAP发展过程中的作用，并通过ROC曲线下面积得出结论：将三种指标综合分析是ALI患者是否发生VAP的预测指标。

ARDS在渗出期(第一天)和恢复期(第五天)对肺泡巨噬细胞蛋白表达的差异，在渗出期蛋白表达扩大和保持了炎症反应，恢复期蛋白下调炎症反应，可避免进一步组织损伤和肺内炎症进展，蛋白可引起功能的改变，为ALI/ARDS诊断和预测预后提供了有价值的生物学标志物。135种蛋白在渗出期和恢复期有表达差异，其中17种蛋白表达在恢复期明显增加，10种蛋白在渗出期呈明显高表达。X选择S100A9(恢复期)和HSP27(渗出期)进行western bolt验证，通过鉴定蛋白寻找炎症反应规律、细胞骨架组织、氧化应激、细胞调亡和代谢，以期探索早期诊断和预测预后的生物学标志物[11]。

应用同位素相对标记与绝对定量技术(Isobaric tag for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技术研究ARDS和正常人血浆蛋白差异比较，ARDS组根据病因不同分为直接肺损伤和间接肺损伤，16种蛋白在ARDS组与正常组表达有差异，其中11种蛋白在直接肺损伤和间接肺损伤中均有表达，5种蛋白仅在间接肺损伤中有所表达，生物学过程主要为脂质运输和补体激活，分子功能主要为脂质运输、丝氨酸肽酶。信号网络分析显示多种重叠蛋白，包括：急性期反应; 肝脏X受体/维甲类X受体 (liver X receptor/ retinoid x receptor, LXR/RXR) 、活化的farnesoid X (FXR)/RXR 、网格蛋白介导的内吞作用、动脉粥样硬化、白介素-12、补体系统、细胞因子、一氧化氮等，为ARDS的诊断提供了新的候选生物学标志物并阐述了其潜在病理学机制[12]。

近期一项研究分析ARDS幸存者与死亡者蛋白表达差异，开始机械通气后分为早期组(1～7 d)和晚期组(8～35 d)，根据预后可分为早期存活者和早期死亡者、晚期存活者三组[13]。通过iTRAQ标记进行质谱分析鉴定蛋白，并应用ELISA法进行验证可见Clara细胞分泌蛋白、膜突蛋白和基质金属蛋白酶9，这些蛋白在早期死亡者中水平升高。在早期存活者中，纤溶酶原、抗凝血酶Ⅲ、因子12、血浆铜蓝蛋白表达活跃，在早期死亡者中，S-100与硫氧化还原蛋白表达升高。基因富集分析显示：在早期存活者与死亡者中，早期存活者可表达出免疫反应激活、细胞阳离子稳态、铁离子稳态、凝血激活、凝血抑制等。死亡者可表达出胶原代谢过程、葡萄糖分解过程、肌动蛋白细胞骨架重组。

2. 基础研究：Menoret等[14]通过吸入金黄色葡萄球菌肠毒素A，增强毛细血管通透性和细胞损伤、增加肺中蛋白和细胞因子浓度以制造ALI小鼠模型，通过肺泡灌洗液寻找在临床症状出现前预测ALI的生物学标志物，应用蛋白组学方法比较吸入金黄色葡萄球菌肠毒素A16h后的肺泡灌洗液与仅应用赋形剂治疗的小鼠肺泡灌洗液，在吸入金黄色葡萄球菌肠毒素A的肺泡灌洗液中出现细胞色素b5和细胞角蛋白17。细胞色素b5在细支气管上皮细胞表达。肺损伤开始时，造模组细胞色素b5明显下降。细胞角蛋白17广泛存在于肺组织中，并在吸入金黄色葡萄球菌肠毒素A的肺泡灌洗液中表达增强，这些新的生物学标志物能够预测ALI的发生，并为肺损伤机制提供新思路。

Bhargava等[15]制造大鼠ARDS模型，应用iTRAQ和质谱分析在损伤肺中研究肺泡Ⅱ型上皮细胞的改变对恢复机制的作用，183种蛋白在损伤恢复过程中明显变化，基因富集分析鉴定这些蛋白的作用主要在细胞周期、细胞分化、细胞代谢、离子平衡、程序性细胞死亡、泛素化等方面发挥作用，同时发现两条活跃的信号通路：JNK、miR374。AT2细胞蛋白在高氧应激时发生了一系列变化。

针对假单胞菌诱导的ALI大鼠与正常大鼠的肺组织进行差异蛋白比较，结果发现18种差异蛋白，其中PRDX1是炎症启动因子，并通过RT-PCR、western blot、免疫组化法进行验证，可能成为ALI新的潜在治疗靶点[16]。

内毒素引起的ALI大鼠上皮衬液研究，对支气管微量采样进行蛋白组学研究，在已治疗的内毒素大鼠组与肿瘤坏死因子相关蛋白的分子量一致，在应用肿瘤坏死因子转化酶抑制剂治疗的大鼠中，这些蛋白的浓度下降或消失，在输注内毒素后6和24 h对未进行气管切开术的大鼠进行支气管微量采样，可检测出多种细胞因子如IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α和IFN-γ，这种新的大鼠支气管微量采样技术可以测定内毒素导致的急性肺损伤TNF-γ浓度，也可以做蛋白组学分析，并且这个过程能够连续的收集上皮层衬液，以检测大鼠急性肺损伤模型时间依赖性细胞因子的变化[17]。

综上所述，针对ARDS蛋白组学的临床及基础研究有利于揭示ARDS发病机制，同时生物学标志物有利于我们早期识别ARDS，并用于危险分层、评价疗效和预后[18]。

三、研究前景与展望

如果能对ARDS发病过程进行有效干预，或对其发病能够进行早期准确的诊断，对于降低ARDS发病风险以及改善患者生存状况必将产生深远的影响。通过蛋白组学技术有助于我们探明ARDS的发生、发展的分子机制，并对ARDS的预防、诊断及靶向治疗提供依据。人们对ARDS发病机理，尤其是分子水平的了解非常有限；对于ARDS的诊断缺乏客观准确的标准。如果能在这两个方面开展相应的工作，必将对ARDS的临床治疗产生积极的影响。

蛋白组学技术能够在一定程度上反映出疾病的发病机制及蛋白的相互作用，但仅针对低分子量、低丰度蛋白等有限范围的蛋白质，因此，ARDS肺泡灌洗液的蛋白组学技术仍存在一定的局限性，有待于进一步改进和完善[19]。

参考文献

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(本文编辑：黄红稷)

任珊，席修明. 急性呼吸窘迫综合征患者肺泡灌洗液蛋白组学研究进展[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2015， 8(3)： 367-369.

·综述·

收稿日期：(2015-04-23)

文献标识码：中图法分类号： R563 A

通讯作者：席修明，Email：xxm2937@sina.com

基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金联合资助课题(2013BSXKD0009)

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.03.027