催产素对于应激孕鼠母性攻击行为的影响及其机制的探究

李松， 张丽华

实验论著

催产素对于应激孕鼠母性攻击行为的影响及其机制的探究

李松， 张丽华

目的 观察不同剂量催产素对应激孕鼠母性攻击行为的影响以探讨其保护性作用机制。方法 将40只Wistar孕鼠随机分为低、中、高剂量催产素组和生理盐水组，每组各10只，待孕期第14天至分娩日给予强迫游泳实验，每日1次，其中低、中、高剂量催产素组每次应激前于腹腔分别给予0.3、1.0、2.0 mg/kg催产素(均稀释成1 mL的溶液)；生理盐水组应激前给予等体积生理盐水。并于分娩后第3天进行攻击行为观察，比较各组行为指标如撕咬次数、攀压次数、攻击次数、攻击持续时间、攻击潜伏期等的差异。之后分别用HE染色和免疫组织化学法检测大鼠视上核、室旁核催产素神经元核团损伤变化以及催产素表达状况。结果 在撕咬次数方面，中、高剂量催产素组均明显高于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.01)；攻击总数方面，高剂量催产素组高于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)；攻击持续时间方面，中、高剂量催产素组低于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)；攻击潜伏期方面，中、高剂量催产素组显著高于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.01)。HE染色显示，视上核中可见，4组之间在核团神经元核染、数量、密度方面比较差异有统计学意义(P<0.01)；室旁核中可见，生理盐水组与高剂量催产素组在核团灰密度分布方面比较差异有统计学意义(P<0.05)，低、中剂量催产素组和生理盐水组3组间差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组织化学结果显示，视上核中低剂量催产素组与生理盐水组灰度值比较差异无统计学意义(P>0.05)，高剂量催产素组与生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.01)；室旁核中，中剂量催产素组与生理盐水组灰度值比较差异有统计学意义(P<0.01)，低剂量催产素组和生理盐水组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 应激会明显损害孕鼠的攻击能力，使用催产素可调节应激对母性攻击行为的影响，可以调节脑部催产素神经核团的表达水平，减缓催产素神经元胞核的肿胀、溶解。

攻击行为； 应激模型； 催产素； HE染色； 免疫组织化学； Wistar大鼠

母性攻击行为是哺乳动物(尤其是啮齿类动物)为应对外侵、保护领地后代、获取空间而发挥的正常生理性适应行为，主要表现为一系列的行为特征，如追逐、攀压、攻击、竖毛等对幼崽有益的行为表现，属于本能应激性行为，涉及心理、躯体、神经内分泌、基因遗传、分子生物等一系列因素或机制，在动物畜牧学和行为医学中隶属最高级的防御性行为，为物种延续所必需[1]。

有国外研究发现，恶性应激会不同程度地损伤破坏母鼠的攻击行为，从而会降低幼崽存活率[2]。目前已知应激反应中会有多种激素释放，其中以糖皮质激素和儿茶酚胺类激素增加最为显著，亦有少量催产素的释放。而对于催产素在应激中是如何发挥作用的，相关报道较少。

催产素又称缩宫素，由下丘脑视上核和室旁核共同合成分泌，临床基础实验常用来进行助产、止血、泌乳，而最新研究表明其还具有抗应激焦虑、缓解压力、减轻疼痛、忠贞配偶、增加性行为和调节母子亲密性的作用[3]。故本研究通过复制经典应激模型的方法，然后给予不同剂量的催产素进行干预，观察应激后母性攻击行为的变化；通过HE染色和免疫组织化学染色检测下丘脑视上核、室旁核中催产素神经元的分布以及催产素表达水平，进而从分子生物学的角度来分析探讨母性攻击行为的损伤机制以及调节保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级Wistar大鼠60只，由大连医科大学实验动物中心提供(合格证号：SCXK(辽)2008-0002)，其中孕大鼠40只，体质量(260±30)g；性成熟未交配雄鼠(未与上述孕鼠交配，作为入侵鼠)20只，体质量(250±25)g。饲养室条件:密闭隔音，室温22～25 ℃，光照明暗12 h∶12 h，自由摄食饮水。动物雌、雄分养，购置后适应性饲养1周。

1.2 主要试剂 注射器、专用Wistar大鼠催产素注射液(佳木斯大学生命科学中心提供)，催产素免疫组织化学试剂盒(购自哈尔滨信斯特生物科技有限公司)。

1.3 器材 VHS16路摄像系统(日本富士公司)；强迫游泳筒：根据文献[4]自制，圆柱状筒高50 cm，直径30 cm，水深40 cm；攻击行为实验箱：61 cm×41 cm×51 cm，上方覆盖两块透明玻璃板，里面均匀铺上一层约1 cm厚的干燥木屑[5]；Smart-16动物行为学分析软件系统(上海软隆科技发展有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 模型制备 参照经典强迫游泳造模方法进行[6]。40只孕鼠按随机数字表法分为4组，低、中、高剂量催产素组和生理盐水组，每组各10只。于孕期第14日至分娩当日期间，每日1次，在应激前分别给予低、中、高剂量催产素组孕鼠腹腔注射0.3、1.0、2.0 mg/kg催产素(均稀释成1 mL的溶液)，生理盐水组给予等体积的生理盐水。注射10 min后，将大鼠放入设定温度(19～21 ℃)的强迫游泳筒内游泳10 min，每次游泳完毕后擦干，直接放回干燥的窝笼中。

1.4.2 母性攻击行为实验 分娩后第3天，在安静自然光线下进行，每次实验前把母鼠和幼崽放入攻击行为实验箱内适应2 min，之后将入侵鼠放入箱内，开始视频拍摄10 min。观察指标如下：(1)攻击总数:包括撕咬、攀压、追逐行为的总次数；(2)攻击潜伏期：从入侵者放入箱内到母鼠发起第一次攻击入侵鼠的时间；(3)攻击持续时间：母鼠反击入侵鼠的总时间；(4)撕咬次数：对入侵者项部或背部撕咬；(5)攀压次数：母鼠将入侵者压在身体下或是用身体将入侵者挤到一边；(6)追逐次数：入侵者追逐母鼠的次数。

有效的母性攻击行为判定标准：(1)入侵鼠向仔鼠进行嗅探式地靠近；(2)母鼠正处于哺乳状态或正在舔仔修饰；(3)母鼠有用前爪扒开入侵鼠的动作或者是母鼠和入侵鼠争相叼仔；(4)入侵鼠有猛烈嗅探母鼠生殖器区的动作(表现为用力“向前拱”)；(5)母鼠主动地发起攻击或攀压追逐；(6)除去下列行为，包括撕咬要害部位(喉)或攻击生殖器，食崽发生，入侵鼠投降后母鼠仍然攻击，入侵鼠受伤无法跑动等。

1.5 病理学检测 行为实验结束后，用10%水合氯醛5 mL/kg腹腔麻醉后，固定于塑料板上，剪开胸廓暴露心脏，找到右心耳剪破，先通过40 mL生理盐水灌洗，再用多聚甲醛40 mL灌注固定至少1 d，专用刀片标尺定位切取脑片，多聚甲醛固定48～72 h，按图谱切取需要的部分(厚度2 mm)，用罗网固定好，放在50%～100% 6个梯度的乙醇中充分脱水，之后用二甲苯透明，除去乙醇，然后石蜡包埋，切片厚度4 μm左右，备用，然后进行HE染色和免疫组织化学处理。

1.5.1 HE染色 透明脱蜡：二甲苯2次，时间5 min。乙醇脱水:100%～70%乙醇分5个梯度，每个梯度3 min，自来水冲洗。苏木精染色：溶液染色2～3 min，如上洗去多余染料。伊红染色：溶液染色2～3 min，如上洗去多余染料。乙醇脱水浸泡：80%～100%分为5个梯度进行，每个梯度1 min。透明：二甲苯Ⅰ 2 min，二甲苯Ⅱ 2 min，二甲苯Ⅲ 2 min。封固：中性树胶溶液滴封，加盖玻片。镜检：观察室旁核、视上核神经元核染变化情况。结果判定：在显微镜下(×400)进行计数，取平均值。

1.5.2 免疫组织化学染色 抗原修复：脱蜡完毕后，放入槽网中的容器中，用自来水进行冲洗，时间尽量长一些，使多余的乙醇可以冲去，之后加入过氧化氢进行浸没，以消除过氧化物酶的影响。自来水冲洗，除去残余。加入柠檬酸缓冲液，浸没。放在微波炉中火直至沸腾，时间不易过长，一般5 min内。这样可充分暴露结合位点。血清封闭：倒掉缓冲液，在自来水下冲洗一段时间。然后放入磷酸盐缓冲液(phosphate buffled saline,PBS)中，浸没。边擦干边滴加血清，以刚刚可以将脑片浸没为宜。之后放入温箱中备用。血清稀释10倍。加一抗：打开温箱将玻片放于实验桌上，擦干玻片上的血清。取出冰箱中的一抗，用加样枪小心滴加。尽量使一抗浸没组织，加量均匀，之后放入冰箱备用。加二抗：上一步骤的玻片，用PBS液冲洗，时间长一些。擦干多余的PBS液之后，滴加二抗，置于温箱中备用。加链霉亲和素-生物素复合物(strept avidin-biotin complex，SABC)：上一步骤的玻片，用PBS液冲洗，时间长一些(大约5 min)。擦干多余的PBS液之后，滴加SABC，置于温箱备用。SABC需要稀释100倍。加显色剂：上一步骤的玻片，用PBS液冲洗，时间长一些。擦干多余的PBS液之后，滴加显色剂。复染：将显色玻片用自来水冲洗，时间长一些，然后浸没染料中，时间1 min左右。脱水：复染片用自来水冲洗后，放入不同梯度的乙醇中脱水透明。然后浸没于二甲苯中备用。封固：先将玻片捞出，在吸水纸上擦干，使多余二甲苯消除。边滴加中性树脂边盖玻片，然后置于通风处晾干备用。镜检：观察待检核团中催产素表达情况。结果判定：催产素表达处呈现土黄或棕黄色，阴性不着色。采用Image Pro Plus 6.0软件进行灰度值测定。

2 结果

2.1 各组攻击行为实验结果 见表1。

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01。

表1结果表明，4组攻击行为相关指标检测结果比较差异均有统计学意义(P<0.01)。进一步进行两两比较，撕咬次数方面，中、高剂量催产素组均明显高于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.01)；攀压次数方面，高剂量催产素组高于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)；攻击总数方面，高剂量催产素组高于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)；攻击持续时间方面，中、高剂量催产素组低于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05，0.01)；攻击潜伏期方面，中、高剂量催产素组均明显高于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 HE染色结果 各剂量催产素组显示，阳性神经元胞核染色清晰，分布均匀不等，细胞排列密集紧凑(图1A、B、C，图2A、B、C，见封三)；生理盐水组阳性神经元胞核染色浅，并有碎裂，而且排列稀疏(图1D、图2D，见封三)。

各组大鼠脑组织HE染色核团数量比较见表2。

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01。

表2结果表明，视上核中可见，低、中、高催产素组与生理盐水组在核团神经元核染、数量、密度方面比较差异有统计学意义(P<0.01)；室旁核中可见，生理盐水组与高剂量催产素组在核团数量、密度分布方面比较差异有统计学意义(P<0.05)，低、中剂量催产素组与生理盐水组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 免疫组织化学染色结果 各剂量催产素组显示，阳性神经元胞核染色清晰，分布均匀不等，细胞排列密集紧凑(图3A、B、C，图4A、B、C，见封三)；生理盐水组阳性神经元胞核染色浅，并有碎裂，而且排列稀疏(图3D、图4D，见封三)。

各组大鼠脑组织催产素表达的灰度值比较见表3。

注：与对照组比较，aP<0.01。

表3结果表明，4组之间在核团神经元核染、数量、密度方面存在不同程度差异。视上核中低剂量催产素组与生理盐水组催产素表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，高剂量催产素组与生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.01)；室旁核中，在位于脑室的下角发现核团较为分散，其中中剂量催产素组与生理盐水组催产素表达水平比较差异有统计学意义(P<0.01)，中剂量催产素组与高剂量催产素组比较差异无统计学意义(P>0.05)，低剂量催产素组和生理盐水组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

在母性攻击行为实验中，本研究选取产后第3天的母仔作为行为评估对象，是基于母鼠在催产素-哺乳时间曲线而作为参照的[7]；作为母性行为的必要部分，母性攻击行为主要是围绕母鼠、幼崽、入侵者三者之间的利害关系而设立的，不同于母爱行为中的亲密关系。有研究表明，母性攻击行为本身就是一种心理应激，正常情况下可以被母鼠体内的神经内分泌系统调节和适应，不会造成焦虑抑郁或其他异常行为[8]。本实验通过观察发现，较催产素组，生理盐水组在撕咬次数、攀压次数、总攻击次数、攻击潜伏期均有不同程度下降，但攻击时间明显延长，这说明应激母鼠保护幼崽免受入侵的能力下降(本实验可见，入侵者在踩压仔鼠时母鼠反应迟钝)，符合之前的文献报道[9]。而高剂量催产素组可见攻击潜伏期明显高于生理盐水组，攻击持续时间明显低于后者，表明催产素可减缓应激对于母性攻击行为的抑制作用，增强母鼠与入侵者间的互动性，以及增进母仔间的嗅探交流[10]；高剂量催产素组在所检测的5项指标中虽与生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.01)(除攀压次数之外)，但与生理盐水组比较发现，其可显著增加撕咬次数、攻击总次数、攻击潜伏期以及减少攻击持续时间，这说明催产素可明显对抗应激给予母性攻击行为带来的抑制效应，改善母鼠应激程度和母仔亲密性，增强对于入侵者的攻击，减少食崽(性)的发生率。另外，低、中、高剂量催产素组3组之间差异有统计学意义，说明催产素对于应激后的母性攻击行为保护作用可能具有一定的剂量依从性；至于催产素剂量是否可以继续增加，需要考虑毒理学意义，国内外文献在啮齿类动物研究中也提及甚少。事实上，在母性攻击行为中也伴随着母爱行为的发生，从而保证了幼崽的存活率以及物种的延续性。

应激时，无论从HE染色还是免疫组织化学染色，都可以镜下发现核团胞核的损伤情况，主要体现在核碎裂、分布稀疏、染色较浅、大小不一、胶质细胞反应性增生、炎细胞浸润等等，这很可能由钙超载引起的(目前研究已发现细胞在应激时受损主要根源于钙超载)[11]。首先催产素作用于膜受体后，引起细胞膜磷脂酰肌醇转变成为三磷酸肌醇和二酰甘油，并导致胞浆中Ca2+浓度增高，导致神经元细胞内Ca2+超载，从而破坏了催产素神经元的大体微细结构(如生理盐水组HE染色所示，胞核小而淡)。其次是通过与G蛋白偶联受体结合，继而激活ATP，引起第二信使cAMP增加，最终导致胞浆中Ca2+浓度增高，致使催产素神经元胞核出现萎缩、通透性升高。最重要的是，钙超载之后的级联反应，即通过引起线粒体内氧化磷酸化过程障碍，降低线粒体膜电位，以及激活胞浆内磷脂酶、蛋白酶来致使神经元细胞发生不可逆性损伤。此外，研究发现，抑制性神经递质(如GABA)也间接性地抑制了催产素神经元的分泌活动，从而加快了核团的萎缩变性[12]。另外，各组催产素神经元表达水平不同程度降低，也可能是由于催产素神经元内的颗粒释放达到了一定的限度(耗竭)而导致其无法与配体进行结合，从而在生理盐水组切片上显得密度值不高。经过催产素干预后的脑部核团如视上核神经元胞核裂解程度和对照组(生理盐水组)相比有了大幅度的降低(如中剂量催产素组、高剂量催产素组HE染色)。尤其是高剂量催产素组更为明显(从棕黄颜色的灰密度值可以看出)。在核团定位切割方面，虽然室旁核是催产素的主要产生部位但是切片切到的只是一个小的冠状面(而立体解剖位置为矢状面稍内)，而在视上核则切到的是一个大的冠状核团(立体解剖方向为冠状面稍内下)，这在中剂量催产素、高剂量催产素组切片上分辨较为容易，由于本切片拍摄的图片都是在同一部位进行切割拍摄的，故(密度值)差别较大，不同于不同切面(密度值差别就相反)所观察到的核团(尤其是室旁核)，这与相关报道一致[13]。所以HE染色能够从宏观方面分析观察到核团的变化分布状况；而免疫组织化学在微观定性定量分析方面看到差异性的存在，继而为分子机制探讨提供更为直观的依据。

总之，强迫游泳所引起的应激反应会破坏分娩后母鼠的母性攻击行为，并且很可能会引发焦虑、抑郁、溃疡性出血等症状的出现。通过给予不同剂量的催产素可以对上述行为起到有效的干预或行为补偿作用，减少神经元的损伤，促进神经可塑性进展。然而催产素对于母性攻击行为的作用机制目前尚不明确，有待于进一步从分子学、基因学、心理学等方面着手探究。

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(本文编辑：刘颖)

Effect and mechanism of oxytocin on maternal aggression in stress model rats during pregnancy period

LISong，ZHANGLihua.

DivisionofCerebralPalsyRehabilitation，theThirdHospitalAffiliatedtoJiamusiUniversity，Jiamusi154002，China.

Objective To investigate the effect and protective mechanism of different-dose of oxytocin on maternal aggression in stress model rats during pregnancy period.Methods Female Wistar rats(n=40) were randomly divided into four groups named group A(n=10)，group B(n=10)， group C(n=10) and group D(n=10). During the intervals from 14thday to due day groups(A，B，C) were intraperitoneally injected with 1 mL dilated solution of 0.3， 1.0， 2.0 mg/kg of oxytocin respectively before the forced swimming once a day; meanwhile, group D as control group was given equal volume of normal saline. Some indexes of maternal aggression were tested, such as biting times， keep-down times， attack times， attack duration and latent period, on the 3rdday of parturition .HE staining and immunohistochemical method were used to test changes of oxytocin nuclei injury and oxytocin expression level.Results Regarding biting times group B and C were significantly different from group D(P<0.01);for attack times group C was different from group D(P<0.05);as to attack duration group B and C were different from group D (P<0.05);for attack latent period group B and group C were significantly different from group D(P<0.01). HE staining showed that in supraoptic nuclei(SON) the four groups were significantly different in staining， numbers and density(P<0.01); in paraventricular nuclei(PVN)，group C was different from group D(P<0.05),while there was no difference in group A，B and D(P>0.05).Immunohistochemical method showed in SON gray density there was no difference in both group A and D(P>0.05); group C was significantly different from group D(P<0.01); in PVN gray density， group B was significantly different from group D(P<0.01)， while there was no difference in group A and D(P>0.05).Conclusion Stress would obviously impair maternal aggression of pregnant rats; different doses of oxytocin could regulate such behavior as influenced by stress and meditate rat brain nuclei oxytocin expression level so that swelling and dissolution of nuclei could be attenuated.

maternal aggression； stress model； oxytocin； HE staining； immunohistochemical method； Wistar rat

154002 黑龙江 佳木斯，佳木斯大学康复医学院研究生处(李松)；佳木斯大学附属第三医院脑瘫康复二科(张丽华)

李松(1983-)，男，2012级佳木斯大学康复医学院硕士研究生在读。研究方向：小儿脑损伤的综合康复治疗。

张丽华，154002 黑龙江 佳木斯，佳木斯大学附属第三医院脑瘫康复二科。

10.3969/j.issn.1674-3865.2015.04.005

R-33

A

1674-3865(2015)04-0306-05

2015-04-19)