离体癫病间模型的研究应用

史娉娉(综述)朱雨岚(审校)

癫痫间是多种原因导致的脑部神经元高度同步化异常放电所致的临床综合征，癫痫间是一种慢性疾病，可迁延数年、数十年乃至整个生命过程，因而对患者身体、精神、婚姻以及社会经济地位等造成严重的不良影响。据统计，我国目前约有900万以上的癫痫间患者，每年新发的癫痫间患者65～70万，其死亡率为1.3～3.6/10万。目前针对癫痫间的发病机制仍不十分清楚，虽有一些新的癫痫间药物的问世，但癫痫间的治疗仍然很困难，相关研究一直是本领域的热点，因此建立癫痫间模型并以此来研究癫痫的发病机制及筛选合适的药物治疗显得尤为重要。癫痫间模型包括动物体内模型和离体模型。自从1883年Openchowski等人首次使用将脑部组织冷冻的方式建立癫痫间动物以来，目前已有数种动物模型应用于癫痫间的研究，绝大多数有关癫痫间发生的理论机制都是直接或间接地通过癫痫间动物模型来研究获得。癫痫间的动物体内模型包括急性癫痫间模型、慢性癫痫间模型、遗传性模型和癫痫间抵抗性模型。由于动物癫痫间发作的多样性以及药物疗效的不稳定性，越来越多的学者致力于研究离体模型。离体模型包括细胞模型和脑片模型，主要用于抗癫痫间药物的筛选，还能有效地探讨抗癫痫间药物的作用机制及量效关系。

1 离体癫痫间模型的发展

1907年Harrison首次通过改良悬滴培养法进行神经细胞培养后，自此人们开始了体外培养技术对神经领域的探索。1991年Stoppini等首次使用Millicell-CM微孔膜对离体培养的海马脑片进行神经电生理研究［1］，使器官型脑片的体外培养技术在神经基础研究领域得以推广。脑片是目前认为最适合用于研究癫痫间的模型。1995年Sombati等利用无镁细胞外液处理培养的海马神经元诱导产生反复自发性惊厥样放电，该模型可作为临床耐药性癫痫间模型［2～3］。目前离体模型根据致痫间方法的不同，又可分为物理模型及化学模型，根据致痫间机制可分为去抑制模型和诱导模型。

2 离体模型的种类

2.1 按取材不同分类

2.1.1 细胞模型细胞模型一般选用出生24h内的乳鼠，使用其大脑皮层细胞和海马神经元作为研究的基础。比较成熟的癫痫间模型有谷氨酸兴奋性模型等。

2.1.2 脑片模型

海马脑片常用动物有豚鼠、大鼠及小鼠等。其模型有低镁液模型、4-氨基吡啶兴奋性模型等。有文献报道用低镁的人工脑脊液灌注海马及内嗅区切片，兴奋NMDA受体，引起钙离子通道开放，形成兴奋性突触后电位，可显示三种癫痫间样放电:(1)海马反复短时程放电;(2)内嗅区癫痫间样放电;(3)内嗅区迟发性重复放电。而且这个用低镁的人工脑脊液处理得到的癫痫间模型的异常放电能被临床有效的抗癫痫间药瑞替加滨(retigabine)所阻断［4］。还有文献报道海马脑片在低钙或高钾的人工脑脊液中同样可以出现类似癫痫间样放电，这些痫间样放电都可以被细胞间电极记录下来，可以认为是研究癫痫间的很好体外模型。

2.2 按诱导方式不同分类 离体低镁/无镁液致痫间模型、离体青霉素致痫间模型、离体高钾癫痫间模型、4-AP癫痫间模型及低钙癫痫间模型。

3 离体模型特点

3.1 离体模型的优点 (1)无血脑屏障及麻醉影响，适用于探索抗癫痫间药物机制。(2)可以模拟体内的生理环境，能在有效地监控细胞周围特定的微环境下施加实验因素;(3)可对活细胞进行观察;(4)可在同一时期或不同时期利用较小的动物提供大量的实验标本;(5)研究样本较均一，减少了个体差异的干扰;(6)易于观察、检测并方便记录研究所需的数据;(7)经济、耗材少。

其中离体脑片模型有其自身的特点和优势，包括(1)兼有在体的脑和离体细胞培养二者的某些特点;(2)脑片可保持整体脑中细胞之间的正常关系;(3)能获得高质量长时间的细胞内记录，常规记录可超过lh;(4)脑片机械稳定性好，不受体内各种因素的影响，从而突出实验的要素，有利于实验研究，有利于筛选抗癫痫间药物。

3.2 离体模型的缺点:(1)所需培养的环境严格，细胞及脑片易死亡;(2)对常规浓度的抗癫痫间药物不敏感，只是以溶度依赖性抑制波幅;(3)培养时所需试剂的量不易掌控，其操作过程复杂。

其中离体脑片模型的缺点:(1)脑片的制作和操作过程比较复杂，脑片没有正常的传人和传出通路，看不到机能或行为的结果;(2)组织的兴奋性水平主要取决于灌流液中的离子浓度以及在制备过程中有损伤等。

4 离体模型的取材

离体模型一般取用鼠的海马组织，海马是癫痫间好发部位，海马神经元是脑内癫痫间样放电兴奋性阈值较低的区域，是癫痫间研究最多的区域。首先，海马组织在取材时相对于其他脑组织结构边界清楚，不容易损伤;其次，海马的内源性及外源性纤维及锥体细胞和颗粒细胞的胞体均按照“层状”面排列，纤维走行均与海马纵轴大致成直角，如刀切的方向合适，可制备出含相当高比例的各种投射纤维和突触联系的脑片，海马还具备特殊的解剖特点，即不仅纤维成层排列，可区别不同纤维束的部位，而且纤维与锥体细胞或颗粒细胞的树突构成突触的部位与胞体有一定的距离，在脑片上很易确定。另外，可以根据研究的需要选择海马的不同层面。

5 各型离体模型的诱发及应用

5.1 离体低镁/无镁液癫痫间模型

低镁的模型发展史:其的发展历史已有几十年，已广泛用于抗癫痫间药物的测定(1986年Walther等人，1993年Coulter和Lee等人，1995年Sombati和Delorenzo等人，2008年Albus等人应用)［2，5～7］。这种模型可以增加癫痫间发作的易感性(1934年Greenberg和Tufts发现)，甚至可以导致人类痫间性发作(1983年ArnoldJD等人，1991年Nuytten等人发现)［8～9］。无镁诱发的海马神经元反复自发痫间性放电与人类癫痫间的电生理表现累似。

离体无镁液模型(包括细胞模型及脑片模型):就是将脑片或或神经元放入无镁液或低镁液中培养，通过膜片钳或微电极可以测得类似于癫痫间样放电。低镁/无镁模型的机制主要因为低镁/无镁降低了对N-甲基-D-天门冬氨酸(Nmethyl-D-aspartate，NMDA)受体的阻断作用，从而使神经元的兴奋性增加出现放电［10］。

有文献报道将海马神经元经无镁液［无镁液(mmol·L):NaCl145，KCl2.5，CaCl22，HEPES10，Glucose10，Glycine0.002，用NaOH调pH至7.3［11］］培养3h后可通过膜片钳测得高幅度的类似癫痫间样自发性放电［12］。当正常细胞外液换成低镁/无镁细胞外液作用0.5h后所有的海马神经元出现自发的放电，开始时波幅和频率均低，作用3h后神经元放电趋于稳定，波幅和频率都很规则［13］。但脑片模型跟细胞模型不同的是，细胞模型在恢复了镁离子的浓度后其痫间样放电停止［11］。

模型优点及应用:(1)离体低镁/无镁液细胞模型可以作为痫间性发作模型或癫痫间发生机制模型;(2)离体低镁/无镁细胞模型因为恢复了镁离子的溶度，其放电现象仍能持续较长时间，这种模型包括了痫间性发作的发生、发展及停止，是研究癫痫间治疗不同的阶段的良好工具，且可作为癫痫间持续状态的模型来研究;(3)此种模型制备简单，无致痫间药物的影响;(4)由于无镁液诱导的癫痫间模型对大多数常用抗癫痫间药的敏感性却是相似的，除可用于兴奋性氨基酸受体拮抗剂的筛选外，尚可用于广谱抗癫痫间药的筛选。

5.2 离体青霉素癫痫间模型

青霉素模型发展史:虽其发展历史也有几十年，但青霉素模型多数还是用于体内模型，许多学者将青霉素腹腔注射或在脑皮质表面应用，成功建立了类似于人类皮质的癫痫间模型。1977年Philip，Schwartzkroin，andDavidAP通过选用青霉素作为致痫间剂用于灌注的豚鼠的海马组织薄片中，在体外记录到神经元的去极化，出现了类似于癫痫间样放电，同时表明了树突参与了癫痫间样放电［14］。

有文献记载致痫间剂青霉素的作用机制是通过“锁闭”GABA能神经元，解除锥体细胞的回返抑制，使其它神经元兴奋性增强，发生阵发性去极化飘移、同步放电和痫间样发作［15］;而有些学者认为其机制是青霉素能使海马锥体神经元里的钙离子增加，而引发癫痫间样放电［16］。

国内已有学者成功建立了离体的青霉素模型，青霉素有致海马脑片癫痫间样放电作用，且与浓度有关，在浓度2000 IU/mL下群峰电位的个数大于3～5个，幅度大于3～5mV，有明显的癫痫间样放电，并成功地在此癫痫间的基础上测定了抗癫痫间药苯巴比妥和苯妥英钠药物量效关系，实验结果和临床结果表现为基本一致［17］。

模型优点及应用:(1)离体青霉素脑片模型具有实验手段简单，方法灵活;(2)易于建立药物量效关系等优点，可用于抗癫痫间药物筛选和研究。

5.3 离体高钾癫痫间模型

高钾脑片模型(以海马切片为主)是一个传统的癫痫间模型，其致痫间作用主要是通过增加神经元的放电频率，并激活部分阈值高的神经元也参与同步化的放电，从而引起类似发作间期痫间性放电的簇样放电［18］。

在体外海马脑片研究显示增加细胞外钾离子浓度可以引起较为可靠地模拟癫痫间样放电［19～20］。离体实验中当ACSF中细胞外钾离子浓度从3～3.5mmol/L升高至8.5 mmol/L时，即可诱发脑片痫间样放电［19］，痫间样放电可长达3h［20］。这种由于增加胞外钾离子浓度诱发的癫痫间发作活动，能被标准的抗惊厥药所抑制。在体实验中当细胞外K+浓度提高至11mmol/L而同时降低Ca2+浓度时，能诱发大鼠齿状回癫痫间的发作［21］。

5.4 4-AP癫痫间模型

4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)是一种瞬时钾离子电流阻滞剂，能在不同物种上诱发痫间样放电，包括人类。

低浓度(100μmol/l)的4-AP能影响瞬时钾电流，引发癫痫间样活动(seizure-likeevents，SLE)以及发作间期癫痫间样放电(interictalepileptiformdischarges，IED)［4］。在大鼠海马旁的结构中如内嗅皮质、海马下托、颞叶新皮层以及杏仁核4-AP都能引出癫痫间发作活动。记录到50mmol/L或100 mmol/L4-AP作用脑片40min后癫痫间发作活动开始出现［21］。这些癫痫间发作活动对所有的标准性抗惊厥药有反应如瑞替加滨(retigabine)。荷苞牡丹碱(Bicuculline)结合4-AP的应用能够将4-AP引起发的SLE及IED转变为复发性痫间样放电(recurrentepileptiformdischarges，RED)［4］。

模型的优点及应用:(1)该模型可模拟脑内不同部位的癫痫间模型;(2)适用于多种抗癫痫间药物的筛选。

5.5 低钙癫痫间模型

低钙癫痫间模型是将脑片放置于低钙的溶液中，当钙离子浓度低于0.2mmol/L时，产生类似于癫痫间样放电［24］。

有文献报道，细胞外低钙离子浓度可以诱发规则的癫痫间发作样活动，持续时间大约为30s，并且能规律性地重复发生［23］。浸浴在低钙液中的海马脑片CA1区可出现类似癫痫间样的活动，且可持续数分钟［22］，但其作用机制与钙激活钾电流、突触抑制、阻滞表面电荷的通过等机制有关。

6 结束语

目前研究癫痫间的发病机理及药物治疗仍主要依靠体内模型，因为体内癫痫间模型与人类癫痫间发作存在相似性，其机理也接近人类发作时的病理生理状态，而离体模型排除了体内癫痫间模型的个体的差异性、药物疗效的不稳定性、癫痫间发作的多样性以及体内血脑屏障和调节系统影响，以至于近年来有些学者开始致力于研究癫痫间离体模型，大量实验证明建立离体癫痫间模型方法灵活，易于建立药物量效关系等优点。由于体内模型及离体模型各有各的优点，研究癫痫间的发病机制以及药物治疗应该从体内及体外两个方向同时进行。但不管是体内模型还是离体模型，对于抗癫痫间药物的作用结果只能提供选择的机会，但真正证实抗癫痫间作用的效果，应在患者身上得以证实。

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