葡萄脱毒与病毒检测技术研究进展

姚延兴 金莉 宿福园 李长林 杨守坤 裴忺

（湖北省武汉市林业果树科学研究所 武汉 430065）

葡萄脱毒与病毒检测技术研究进展

姚延兴 金莉 宿福园 李长林 杨守坤 裴忺

（湖北省武汉市林业果树科学研究所 武汉 430065）

葡萄（Vitisspp.）是全世界主栽果树之一，由于其主要通过扦插和嫁接等无性繁殖方法进行繁殖，导致葡萄易被病毒感染,病毒在植株内长期积累和重复感染。使得葡萄病毒病具有种类多、分布广、危害大的特点[1]，已成为全世界关注的果树问题之一[2]。

脱毒和病毒检测是实现葡萄无毒化栽培的关键技术，目前常用脱毒方法有热处理脱毒法、茎尖培养脱毒法和使用病毒抑制剂抗毒法，比较理想的脱毒方法是将这三种方法结合使用。

1 葡萄主要病毒病侵害的研究

1.1 葡萄扇叶病

葡萄扇叶病（Grapevine fan leaf disease）起源于欧洲、北美的葡萄砧木，是目前研究最深入的一种葡萄病毒病，也是世界上分布最广泛的葡萄病毒病之一。该病的病原为豇豆花叶病毒科线虫传多面体病毒属病毒，主要是通过葡萄无性繁殖传播，也可通过土壤线虫进行传播。病株症状可表现为叶片呈扇子状、黄化，成熟叶片沿主脉产生黄斑，叶片畸形、不对称，叶蔓从生、矮化，叶柄凹大开张。该病导致果实产量下降，并降低果实品质[3]。1990年代，人们对该病毒进行了全部核酸序列测定和外壳蛋白基因的序列分析[4][5]，有效解决了该病毒在不同株系、不同品种上的症状表现差异大，难以通过症状进行鉴定的难题。

1.2 葡萄卷叶病

葡萄卷叶病（Grapevine leaf roll disease）分布广泛，所有葡萄品种皆会发生此病。该病毒的病原葡萄卷叶病毒，是长线形病毒科长线形病毒属病毒，主要通过葡萄无性繁殖进行传播。卷叶病具有阶段隐症的特点，通常感病后不会立即表现出症状，生长后期才会表现出明显症状，且症状因病株生长条件的不同也会表现出差异。主要表现为叶片向背面反卷，叶脉间出现坏死斑，病叶除叶脉外叶片变为红色或红褐色，病株果穗变小，品质下降，产量降低[6]，该病还可导致葡萄果实成熟推迟，扦插难成活，抗逆性差。该病症状在夏末秋初尤为明显。

1.3 葡萄栓皮病

葡萄栓皮病（Grapevine corky bark diaease）是由一种潜隐性病毒侵染而引起的病毒病，该病相关报道相对较少，病原目前尚不清楚。该病主要是通过嫁接传播，Hewitt于1954年首次对葡萄栓皮病的症状进行了描述[7]，症状表现为病株萌芽迟缓，枝蔓和树皮产生裂缝，叶片变小、下卷，果实延迟成熟，品质下降。

1.4 葡萄茎痘病

葡萄茎痘病（Grapevine stem-pittingdisease）可以通过嫁接传播，其病原尚不清楚。据报道，通过核苷酸序列比对发现，葡萄茎痘病毒（Grapevinestem-pitting disease）与苹果茎痘病毒（Aapple stempitting virus）、马铃薯 M病毒（Potato stem-pittingvirus）和马铃薯X病毒（Potato X virus） 相似[8]。另有研究报道，该病可能与番茄环斑病毒（Tomato ringspot Nepovirus） 和葡萄扇叶病毒有关。植株感染此病后春天萌芽迟，树体生长缓慢、矮小，长势衰弱，树皮粗糙、木栓化，嫁接口愈合能力下降。

1.5 葡萄斑点病

葡萄斑点病（Grapevine fleck disease）是一类在大多数葡萄种上不表现出症状的病毒病，沙地葡萄是此病害较好的指示植物。该病的病原为直径大约30nm的球状葡萄斑点病毒。该病毒主要通过嫁接进行传播，对葡萄植株进行潜伏侵染，大多数葡萄感染此病毒后，田间并不表现症状，但在沙地葡萄上症状表现明显，感病植株的叶片会出现局部斑点，在三、四级小叶脉上出现脉明，同时出现叶片皱缩、扭曲并向上卷曲的症状，还可出现不同程度矮化现象。

2 葡萄主要脱毒技术的研究

2.1 热处理脱毒

热处理脱毒主要是指应用不影响寄主植物正常生长的高温，利用病毒在高温下不稳定的特点，将携带病毒的葡萄植株或组织器官在高温下进行培养，使病毒在高温下钝化、失活，达到脱毒目的，热处理包括恒温处理和变温处理两种方式，由于受到植物对高温忍耐度的限制，单独使用该法脱毒率较低，且高温仅对圆形和线性病毒有效，对杆状病毒不起作用[9]。

2.2 茎尖培养脱毒

茎尖培养是目前应用最广泛的脱毒方法之一，其脱毒原理是根据病毒粒子在植物体内的分布不均匀，植物茎尖和根尖内病毒含量很低或不含病毒的特点，利用茎尖为外植体进行组织培养获得无毒苗木。早在1960年代，人们已开始利用茎尖培养进行葡萄脱毒研究[10]。茎尖大小与脱毒效果成反比，而茎尖离体培养再生率与茎尖大小成正比。因此，采用适当大小的茎尖进行离体培养，是脱毒成功与否的关键因素。据报道，茎尖大小在 0.2～ 0.5mm之间时葡萄脱毒效果较好[11]。

2.3 化学处理脱毒

化学抑制剂主要是通过延迟或抑制病毒的复制而发挥作用的[12]。目前主要的病毒抑制剂有病毒唑、板蓝根、鸟嘌呤和尿嘧啶类等多种物质，在植物组织培养过程中，在培养基中加入适当的病毒抑制剂，可以达到脱除外植体病毒的效果。如在1980年，Cassells在马铃薯组织培养过程中，通过在培养基中加入病毒唑，获得了马铃薯脱毒植株[13]。

目前，葡萄脱毒常用的方法就是以上 3种，但每种脱毒方法都有自身的不足。实际生产中，通常将几种脱毒方法结合使用，其中应用最广泛的是热处理与茎尖培养结合脱毒，可获得较好的脱毒效果。

3 葡萄病毒检测技术的研究

3.1 指示植物检测法

指示植物检测病毒法的原理就是利用某些植物对某些病毒的感染非常敏感，能够很快表现出病征的特性来检测植株是否带毒，常采用汁液摩擦和嫁接传染的方法对指示植物进行病毒接种。该方法是常用的病毒检测技术，具有成本低，操作简便的优点。在葡萄栓皮病毒和葡萄扇叶病毒的检测中取得了很好的效果[14]，但对复合侵染或具有阶段性隐性症状特点的病毒无法通过该法检测。

3.2 血清学检测法

3.3 分子生物学检测法

分子生物学检测是从核酸水平来检测病毒是否存在，主要包括聚合酶链式反应（PCR）、双链RNA（dsRNA）法及分子杂交法。其中，聚合酶链式反应又包括反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和免疫捕捉反转录聚合酶链式反应（IC-RT-PCR），因为比血清学方法灵敏度高，所以，分子生物学检测法应用更广。

3.3.1 聚合酶链式反应技术。PCR病毒检

由于病毒可以刺激机体产生相应的抗体，而这种抗体与其相应的抗原可发生特异反应，因此可通过已知病毒的抗血清来鉴定病毒种类，血清学方法检测植物病毒就是利用了血清反应的这一原理来实现的。酶联免疫吸附测定（ELISA）是目前应用最多的血清学检测法，此法主要包括双抗体夹心法ELISA（DAS-ELISA）和 A蛋白双抗夹心ELISA两种，其中，DAS-ELISA在植物病毒检测中应用的更为广泛。ELISA在对葡萄扇叶病毒、葡萄卷叶病毒的检测中均获得了很好的效果[15-16]。但是，血清学检测法在实际应用中存在易产生假阳性的缺陷，降低了其使用效率。测技术主要包括反转录RT-PCR和IC-RT-PCR两种。PCR技术可以对任何植物病毒基因组的少量DNA进行扩增，再利用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测[17]。RT-PCR检测法是利用大多数植物病毒为RNA病毒这一特点，进行病毒检测前，将病毒RNA反转录合成cDNA，然后将cDNA进行连续扩增，用于病毒检测分析。IC-RT-PCR法是将ELISA与RTPCR相结合进行病毒检测的方法。前人的研究发现，对葡萄病毒的检测中，IC-RT-PCR检测效果优于DAS-ELISA和RT-PCR[18]。

3.3.2 双链RNA法。由于绝大多数植物病毒基因组为单链RNA，病毒侵染植物组织后会复制、配对成具有特异性的双链RNA，只要植物组织中存在病毒，就会存在与其对应的dsRNA，因而可以利用这些dsRNA对植物组织进行病毒检测[19]。主要技术方法是提取感病组织中的dsRNA，然后进行凝胶电泳分析，根据dsRNA谱带的迁移率确定感染病毒的种类[20]。1970年代末期，dsRNA法已经开始用于植物病毒的研究当中[21]，到1990年代，Habili等又从感染葡萄卷叶病毒的葡萄植株中提取到三种特异性的大分子dsRNA，大小分别为19.5kb，1.9kb，0.9kb[22]。

3.3.3 分子杂交法。分子杂交法又称为核酸探针检测法，起源于1980年代，是利用病毒核苷酸的互补序列作为探针，与病毒核苷酸单链通过碱基配对形成杂合双链，对病毒整个基因组或部分基因组进行检测与分析的方法。常见的杂交方法包括斑点杂交、印迹原位杂交和印迹法等。对于DNA、RNA及类病毒，均可用分子杂交法进行检测，且特异性强、灵敏度高、操作简便。目前，许多种类葡萄病毒如：葡萄卷叶病毒、葡萄扇叶病毒的核酸探针都已合成且已成功用于病毒检测[23]，其中，对葡萄扇叶病毒分子杂交检测灵敏度已达到pg级水平[24]。

4 现状及展望

目前，葡萄产业发展迅猛，葡萄种植面积不断扩大，但病毒病的危害也日益严重，对葡萄的品质与产量都造成了严重影响。为了克服或降低病毒病带来的危害，科技工作者不断努力，各种脱毒方法也应运而生，但葡萄脱毒效果与葡萄品种及所采用的脱毒方法都有关系。当前实际生产中，任意一种脱毒方法单独作用，效果通常无法令人满意，通常多种脱毒方法结合使用脱毒效果较好。在脱毒效果检测方面，指示植物法与血清学检测法操作繁琐，检测结果易受假阳性干扰，使用范围有限。分子生物学检测法，灵敏度高，操作简便快速，在葡萄病毒检测方面具有巨大潜力和发展前景。

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10.139906/j.cnki.zjjgjj.1009-0584.2015.03.221

2015- 5- 8