枯草芽胞杆菌发酵对玉米干酒糟氨基酸组成的影响及发酵条件研究

■董文豪 史慧玲 郝晓鸣 乔家运 范 寰， 王文杰，

（1.天津师范大学生命科学学院，天津 300386；2.天津市畜牧兽医研究所，天津 300112）

玉米DDGS又称玉米干酒槽（Distillers Dried Grains with Soluble,DDGS），是一种廉价的高蛋白饲料，含有丰富的蛋白质、氨基酸、脂肪、纤维素、钙和磷等，在家禽饲料中均有广泛应用。Ham等对生长肥育牛的饲养试验结果表明，饲喂酒糟副产品（DDGS）的生长肥育牛增重速度和效率均高于压扁玉米（DRC）（P＜0.05），McClelland等报道，在猪日粮中添加不同量的玉米DDGS后，随DDGS喂食水平的增加，猪的腹部柔软度上升，背膘和腹部的不饱和脂肪酸呈线性增加，肉质中含碘量也随之增加。与玉米谷物相比玉米DDGS中的粗蛋白含量显著提高，并高达28%～30%，但是，据报道不同来源DDGS的粗蛋白含量有很大差异，而且DDGS中粗蛋白在不同畜种不同生长阶段动物肠道中的可消化利用率也不相同。此外，猪日粮中第一、第二限制性氨基酸（Lys和Met）在DDGS的加工过程中也较易受到高温的损坏。Hughes等报道，DDGS氨基酸组成不平衡，Lys含量较低。上述因素均影响了DDGS在动物饲料中的应用推广，因此，DDGS在动物饲料应用过程中，如何减少Lys和Met在加工过程中的损失以及提高消化率都成为人们关注的主要内容。

动物饲料发酵技术是指利用微生物代谢功能，通过微生物自身细胞或者酶，将饲料中的有机物质转化为对动物生长有利的营养物质。枯草芽胞杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽胞杆菌之一，越来越多的被用于饲料微生态制剂的研制。从现有文献来看，枯草芽胞杆菌发酵对玉米干酒糟氨基酸组成的影响尚未有报道，本实验采用枯草芽胞杆菌发酵玉米DDGS，通过设计4因素3水平发酵正交试验，利用日本日立公司L-8900氨基酸分析仪，测定发酵前、不同条件发酵后各组DDGS中氨基酸组成，通过对比分析，筛选出枯草芽胞杆菌发酵玉米DDGS的最佳发酵条件，为今后进一步研究发酵玉米DDGS的试验提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 玉米DDGS饲料样品为市售，营养成分见表1。

表1 玉米DDGS营养成分

1.1.2 枯草芽胞杆菌：天津市畜牧兽医研究所饲料微生物实验室保藏。

1.1.3 枯草芽孢杆菌液体培养基：LB培养基。

1.1.4 试剂：氯化钠、酵母浸粉、胰蛋白胨、氢氧化钠、盐酸，实验用水：均为实验室一级用水。

1.1.5 仪器：恒温培养箱，L-8900氨基酸分析仪，电子分析天平（精确度±0.1 mg），恒温干燥箱，真空干燥器。

1.2 方法

1.2.1 发酵方法

1.2.1.1 菌种活化

将保存于斜面的菌种接一菌环到了LB液体培养基，37 ℃、150 r/min，培养18～22 h，置于4 ℃冰箱保存，备用。

1.2.1.2 枯草芽胞杆菌最佳培养条件

依据枯草芽胞杆菌在不同pH值、温度、转速、时间下生长量的不同，设计5因素4水平正交试验。配制不同pH值的LB液体培养基，将枯草芽胞杆菌活化菌种接入灭菌后的LB液体培养基培养，按表2条件培养，每组设置3个平行，测600 nm处的吸光度值。确定枯草芽胞杆菌最佳培养条件为：培养时间18 h，转速220 r/min，接种量1.6%，温度36 ℃（见表2）。

表2 枯草芽胞杆菌培养正交试验

1.2.1.3 DDGS发酵条件

用1.2.1.1节确定的最佳培养条件培养枯草芽胞杆菌，菌液4℃保存备用。影响枯草芽胞杆菌发酵玉米DDGS的主要因素有发酵pH值、接种量、时间、温度以及含水量，本试验选取发酵pH值、接种量、时间和温度4个因素进行单因素实验，设计4因素3水平正交试验。准确称量15 g玉米DDGS细粉置250 ml三角瓶中，灭菌备用。按照正交表2每瓶加入25 ml不同pH值蒸馏水，依据表3不同条件进行发酵，设置未经发酵组号为1，作为空白对照组，每组共设置6个平行。

1.2.2 氨基酸分析仪测定

1.2.2.1 样品处理

将发酵后饲料样品冻干，制成粉状，准确秤量100～130 mg饲料样品置于试管中，加入10.0 ml 6 mol/l HCl，向试管内通入氮气，抽真空至7 Pa后封口。将试管放在（110±1）℃恒温干燥箱中，酸解22～24 h，冷却，振荡混匀后将管中液体转移至容量瓶，加水定溶至25 ml。取少量定溶液体过滤，置旋转蒸发器，60℃抽真空，直至蒸干。加入3 ml 0.02 mol/l HCl，涡旋混合 1 min，待浓缩物溶解后，过0.22 μm滤膜，供氨基酸分析仪测定。

1.2.2.2 色谱条件

按照日立L-8900氨基酸分析仪说明书的要求配制标准分析用洗脱溶液、茚三铜试剂R1和茚三铜缓冲液R2。泵1流速：0.40 ml/min（压力2.0～15 MPa）；泵2流速：0.35 ml/min（压力0.2～2.0 Mpa）；分析柱温度为57℃；反应器温度为135℃；进样体积：20 μl。通道 1 检测波长为570 nm，通道2检测波长为440 nm，脯氨酸为通道2检测，其余氨基酸均为通道1检测。

1.2.3 数据统计分析

试验数据采用SPSS19.0和CANOCO4.5统计软件进行统计分析。使用SPSS软件中One-way ANOVA进行方差分析，LSD法结合Duncan’s法进行组间多重比较，并结合CANOCO4.5作图分析。

2 结果与讨论

2.1 PCA分析结果及讨论

将提取出来的发酵前、后玉米DDGS各组的17种氨基酸占总氨酸比例的数据，进行主成分分析法（principal component analysis，PCA）分析，如图1所示。图1可以反映样品在坐标图中的关联性，相似的样品可以聚集在一起，存在差异的样品就会分布在坐标图的不同区域，由图1可以看出，发酵前和不同条件发酵后的玉米DDGS组间均存在差异，且组间聚集较好，差异小、重复性好。通过观察，还可以看出第2、第3和第4组分布在一条直线上的不同点，分析是由于他们具有一样的发酵参数pH值，说明是受到接种量、温度和时间的影响导致的。而第5和第6组、第9和第10组均有重叠的部分，观察其发酵参数，是由于他们具有相同的pH值条件。又依据SPSS多因素分析，看出各组氨基酸含量受pH值影响较大，差异显著（P＜0.05）。

2.2 CCA分析结果及讨论

典范对应分析法（canonical correspondence analusis,CCA），常用于从总体上把握两组指标的相关性，利用两组中提取出的代表性指标，来反映两组指标之间的整体相关性。图2是以4个发酵参数和17种氨基酸占各总氨酸比例为原始数据作的CCA排序图。由图2可知，发酵参数中pH值在发酵参数中起主要作用，还可得知，Gly、Val、Lys、Arg、Ser、Leu、Ile、His、Tyr与 pH值、接种量、温度和时间等发酵参数呈正相关关系，而Thr、Met、Phe、Pro、Cys、Ala、Asp、Glu与发酵参数呈负相关关系。其中，Gly、Val和Lys受接种量影响较大；Arg受pH值和时间影响较大，Ser和Leu受温度影响较大。

表3 玉米DDGS发酵正交试验

图1 氨基酸PCA分析

图2 氨基酸CCA分析

限制性氨基酸是指饲料中所含必需氨基酸的量与动物需要量相比相差较大的氨基酸，Lys是猪日粮中的第一限制性氨基酸，也是一些反刍动物的第二限制性氨基酸，在饲料中添加适量的Lys可以提高饲料中粗蛋白的利用，而几乎全部的Lys都可以用于合成机体蛋白质，不会产生具有生物学意义的次级代谢产物。但也有研究表明，添加超过4%含量的Lys，会影响猪的采食、抑制Arg的吸收和合成，不利于猪的生长与生产，因此应添加适量Lys。依据CCA分析可知，通过调节接种量和pH值的大小，可以改变Lys的含量。条件性必需氨基酸是指在动物生长的某一阶段或生理状态下，动物自身合成不能满足需要，必须由饲料提供的氨基酸，有文献报道Arg是高产母猪和断奶仔猪的条件性必须氨基酸，而Gly则是家禽的条件性必需氨基酸。综上所述，可根据动物对氨基酸的不同需求，调节发酵参数，选取最佳发酵条件。

由于本实验旨在研究玉米DDGS发酵前、后氨基酸含量变化，故依据图2筛选出受发酵参数影响较大的代表性氨基酸，如Gly、Val、Lys、Arg、Ser作为筛选发酵参数的依据，通过对比发酵前后氨基酸含量变化，并进行统计学分析，选出相对发酵前氨基酸含量差异较大的一组，即第9组，作为本试验的最佳发酵条件。发酵前后各氨基酸占总氨酸含量对比见表4，发现发酵前、后Lys、Ser、Gly和Val的含量均有显著差异（P＜0.05），说明经过发酵后，玉米DDGS中Lys、Ser、Gly和Val的含量均有显著提高（见表4）。

表4 发酵前、后玉米DDGS17种氨基酸占各组总氨酸比例

Lys和Met是猪生长的第一、第二限制性氨基酸，而通过表4可以看出，发酵后Lys占总氨酸的比例增高0.48%，而Met占总氨酸的比例降低了0.28%，对比发酵前后Met绝对含量减少了0.03%（见表5），说明发酵后，在Lys明显升高的基础上，Met含量减少量较小，同时也说明本发酵改善了玉米DDGS的营养品质，本试验会对玉米DDGS的发酵做进一步的研究。

表5 发酵前、后玉米DDGS中限制性氨基酸含量绝对值

3 结语

本研究采用枯草芽胞杆菌发酵玉米DDGS，利用日立公司L-8900氨基酸分析仪分析发酵前、不同发酵条件后玉米DDGS中氨基酸含量的变化，确定本试验最优发酵参数：pH=9，接种量3 ml，温度为25 ℃，发酵时间48 h；分析发现氨基酸含量受pH值、接种量影响较大，各别氨基酸如Lys、Ser与接种量呈正相关关系，且发酵后一些动物限制性氨基酸，如Lys、Ser等占总氨酸的比例显著增高（P＜0.05）。本试验同时也为今后进一步研究发酵前与发酵后玉米DDGS中氨基酸、脂肪酸等小分子物质的变化提供理论依据。