组织工程骨血管化策略的研究进展

吴骁伟 王 黔 综 述 曹谊林 肖 苒 审校

·综述·

组织工程骨血管化策略的研究进展

吴骁伟 王 黔 综 述 曹谊林 肖 苒 审校

骨组织工程的发展为大段骨缺损的修复提供了新的途径，众多的动物实验研究和逐渐兴起的临床应用研究已充分显示出其巨大的应用前景。然而，组织工程骨细胞支架复合物在植入体内后，尤其植入血供不佳的受区时，因不能及时地与机体建立起血供连接，使得成骨效果不稳定。近年来的研究表明，组织工程骨的血管化已成为构建大段组织工程骨的一个关键因素。我们对组织工程骨血管化策略的研究进展进行综述。

组织工程骨骨缺损血管化

组织工程学（Tissue Engineering）是综合应用工程学和生命科学的基本原理、基本理论、基本技术和基本方法，在体外预先构建一个有生物活性的种植体，然后植入体内，修复组织缺损，替代组织、器官的一部分或全部功能，或作为一种体外装置，暂时替代器官部分功能，达到提高生活、生存质量，延长生命活动的目的[1]。在骨组织工程领域，Goshima等[2]首先在裸鼠体内植入了多孔生物陶瓷-细胞复合物，结果提示有新生骨形成。Bruder等[3]应用间充质干细胞（MSCs）复合羟基磷灰石磷酸三钙（HA-TCP）支架成功修复犬股骨2.1 cm长的节段性缺损。此后，Petite等[4]使用天然珊瑚支架复合间充质干细胞构建组织工程骨，并成功修复了羊2.5 cm长的跖骨缺损。在临床应用方面，Quarto等[5]将hBMSCs接种于HA上，成功修复患者的胫骨、肱骨及尺骨4～7 cm长的节段性骨缺损。随着细胞培养技术的改进和生物反应器的应用，组织工程骨治疗大段骨缺损已显示出广阔的应用前景，但同时也面临着一些亟待解决的问题。

1 血管化构建的必要性

机体的绝大多数组织细胞由血液供应氧气和养料，由于受组织中氧气扩散作用的限制，毛细血管的氧气供应范围局限于邻近100～200 μm的区域[6]。对于细胞-支架复合物而言，体外虽然可以通过应用灌注反应器等方法来加强氧气和养料的供应，一旦植入体内，尤其植入受区血供不佳的区域，支架内的种子细胞早期只能通过临近毛细血管的扩散作用来获得氧气和养料，严重影响了细胞-支架复合物的活性，使得成骨效果不稳定。加之骨组织代谢非常旺盛[7-8]，组织工程骨在体内对周围血液供应的要求更高[5]，为了保证大尺寸的组织工程骨植入体内后能够有效成骨，有必要在其构建过程中采取血管化策略。

2 常用的组织工程骨血管化构建方法

2.1 优化支架材料的设计

材料的孔径、孔隙率、连通率和孔内连接径，是评价组织工程骨支架材料的重要参数，特定的材料有着对于组织工程骨成骨和血管化较为理想的孔径、孔隙率、连通率和孔内连接径。首先，孔径的尺寸对血管的长入是一个至关重要的因素。有研究发现，对于构建组织工程骨较为理想的，能够促进成骨细胞的黏附、迁移、增殖、分化和血管化的材料孔径是300～400 μm，孔径在90～120 μm的HA材料先诱导出软骨进而骨化成骨，而孔径大于350 μm的HA则可以直接诱导成骨[9]。Druecke等[10]的研究表明，孔径大于250 μm的支架材料中血管的长入速度明显加快。其次，孔隙率是材料结构的另一项重要参数。孔隙率指材料内部孔隙体积占其总体积的百分率，高孔隙率的材料有助于营养成分的扩散和代谢废物的排出及血管化，对于高代谢率的器官如肝脏、骨组织等的构建尤为重要。但是，较高的孔隙率会导致材料力学强度降低[11]。此外，孔隙之间的连通率对于血管的长入同样重要，即便是孔隙率很高的支架材料，细胞的迁移、血管的长入在连通率低的支架材料内仍难以进行[12-13]。研究表明，只有孔内连接径大于50 μm才能发生细胞的明显迁移和组织的长入[14]。为了提高成骨和成血管的效果，可以在材料的制备过程中优化孔径的大小，改善孔隙率，增加连通率及内连接径。Gafni等[15]将内皮细胞接种于高降解丝状支架材料，形成了单层内皮细胞包裹的丝，植入体内后丝状材料迅速降解，形成管状的内皮细胞层，并且于2周后发现管状的内皮细胞层形成了血管。

2.2 使用生长因子

众多的研究表明，诸如VEGF、β-FGF等促血管生成的生长因子能够促进植入体内的组织工程复合物的血管化[16]，因为该类生长因子能够直接促进血管内皮细胞的动员游走，加速新生血管的生成；而另一类促血管生成的生长因子则主要在新生血管成熟稳定的过程中起重要作用，包括血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子β（TGF-β）和血管生成素1（Ang-1）等。PDGF能起到动员血管平滑肌细胞和周皮细胞的作用；TGF-β可以促进细胞外基质（ECM）的表达，参与内皮细胞和周细胞之间的信号传导[17-18]；血管生成素1（Ang-1）则通过调节内皮细胞和周围间质、基质的相互作用，在血管成熟和稳定方面起重要作用。在血管化组织工程骨的构建过程中，新生血管的成熟稳定并正常发挥组织营养功能，需要上述两类生长因子的同时作用。研究表明，在组织工程支架中同时使用VEGF和PDGF可以生成大量的成熟血管[19]。

不同于以上两类细胞生长因子，索尼克蛋白（SHH）[20]、缺氧诱导因子1（HIF-1）[21]及骨形态发生蛋白BMP-2、BMP-4、BMP-6等[22]生长因子能够作用于血管周围的细胞，使其分泌促血管化的生长因子。这种间接的促分泌作用具有以下优势：首先，在这类间接生长因子的作用下，细胞分泌一系列的血管源性生长因子，这些生长因子可以直接参与血管的形成和成熟。如间充质细胞能在SHH的作用下分泌包括VEGF、Ang-1和Ang-2在内的一些生长因子[23]；其次，在这种间接因子的作用下，血管源性的生长因子可以在组织中形成浓度梯度，这对于毛细血管的形态发生具有重要作用[24]；最后，这类间接因子还可以通过对细胞分泌的调节，间接地调节其他因子的分泌，使得在血管生成的各个阶段，参与调节的血管源性生长因子的量都是与细胞的生理需求量相适应的，这对于血管的发生、成熟和稳定意义重大。

基因转染技术则是将表达特定血管源性生长因子的基因转染到种子细胞中，使成功转染后的细胞长期稳定地表达相应的血管源性生长因子，从而促进组织工程骨的血管化。常用的转染方法可分为病毒载体转染法和非病毒载体转染法，由于非病毒载体转染法较病毒载体转染容易控制，安全性高，因此大多采用非病毒载体转染法。Geiger等[23]直接将VEGF包被到胶原颗粒中，种植到兔桡骨1.5 cm缺损处，转染6周后VEGF组较单纯胶原颗粒组血管数量和内皮细胞数量明显增多，骨缺损修复效果更明显。但是，也有研究显示，从远期观察来看，使用和不使用VEGF和β-FGF对于体内组织工程复合物的最终成血管效果没有明显的差异，只不过使用VEGF和β-FGF能够加速早期新生血管的生成，缩短血管发生到成熟的过程而已[25]。

2.3 血管预置技术

近年来，血管预置技术已被逐渐应用于构建血管化的组织工程骨。血管预置技术（Prevascular）是在组织工程骨复合物植入体内的过程中，借助于带血供的筋膜、血管束或者血管环等，预先构建好机体和组织工程骨之间的血供连接，以期尽快建立起受区与组织工程复合物的血液供应，促使组织工程复合物最大程度的成活并发挥修复作用。血管预置技术根据新生血管的长入方式和供养方式，主要有以下3种。

2.3.1 有血液供应的筋膜、骨膜或者肌肉包裹预制技术

此时血管的长入及营养方式主要由外周向中心进行。Li等[26]研究发现，使用背阔肌包裹的细胞支架复合物的成骨和血管化的效果明显高于同等条件下的未包裹组。陈滨等[27]使用筋膜瓣包裹成骨诱导分化后BMSCs和珊瑚羟基磷灰石复合物，成功修复山羊胫骨2 cm缺损，证明使用筋膜瓣包裹促进了组织工程骨的成骨能力。Zhang等[28]用骨膜包裹的BMSCs－PLGA复合物修复兔耻骨缺损，发现使用骨膜包裹明显增加了组织工程骨的血管生成和成骨效果。

2.3.2 动静脉血管环路预置技术（AV Loop）

此时组织工程骨内血管的长入和营养方式则是由中心向外周进行的。这种构建方法是基于骨组织的血供主要来源于骨髓腔内轴向血管这一理论，生理情况下至少2/3或3/4的内侧皮质骨的血运由位于中央的骨髓营养动脉的分支供给，皮质骨血流方向是离心性的（由骨髓至骨膜）。受动静脉环路构建出大鼠带轴向血管皮瓣模型[29]的启发，Kneser等[30]首次将动静脉环路技术应用于组织工程骨的血管化策略，该技术能够在小动物（如大鼠）体内的组织工程骨中芽生出大量的新生血管[25]。Beier等[31]则将山羊后肢隐动静脉进行显微外科吻合，在组织工程骨中预置AV loop轴向血供，成功在大动物体内增加了组织工程骨的血管生成。

2.3.3 血管束预置技术（Vascular bundle）

血管束预置技术是介于外周和轴向血供间的血管预置技术。该技术使用远端结扎的血管束穿过组织工程骨表面的凹槽，其血管长入和营养方式介于上述两种预置技术之间[32]。Cai等[33]采用比格犬BMSC接种于HA支架，借助预置血管束的血管化方法成功修复比格犬腓骨缺损，相比对照组，预置血管束的组织工程骨在相同时间点上有着更好的成骨效果。Wang等[34]将BMSC接种于TCP支架，并预置兔的隐动静脉束，成功构建出血管化组织工程骨，并修复兔股骨1.5 cm骨缺损。

虽然上述3种血管预制技术的血管化效果比较尚未见报道，但根据Tanaka等[35]在大鼠腹股沟区使用人工真皮分别包裹动静脉环路、血管流过血管束和远端结扎血管束来比较皮瓣内部新生组织和新生血管的研究结果，虽然包裹动静脉环路的人工真皮内部的新生组织量最多，但是包裹远端结扎血管束组有更多的血管生成，提示使用远端结扎的血管束来构建血管化的组织工程复合物可能是一个较为理想的方法。

2.4 联合使用内皮祖细胞

自Asahara等[35]首次提出内皮祖细胞（Endothelial progenitor cell，EPC）的概念以来，关于EPC的研究日益增多。EPC是血管内皮细胞（Endoththelial Cell，EC）的前体细胞，又称为血管母细胞（Angioblast）。研究表明，EPC不仅仅参与胚胎血管生成，而且在出生后新生血管的形成过程中也具有重要作用。

内皮祖细胞的来源主要有脐静脉、骨髓血和外周血等。人EPCs主要存在于骨髓中，外周血中含量很少，外周血EPCs只占外周血细胞的0.01%。外周血EPCs主要由骨髓动员而来，并趋化至缺血部位。由于脐静脉来源的内皮祖细胞的临床应用面临伦理及异体移植的免疫排斥反应等问题，所以目前最具有研究价值和应用前景的内皮祖细胞应该是骨髓血来源的内皮祖细胞。

研究发现，内皮祖细胞可以在体外培养并形成管状结构，这种管状的结构植入体内后能够与机体形成血管吻合，最终形成功能性的新生血管[37]。近年来，利用血管内皮祖细胞和种子细胞联合培养，以促进组织工程骨血管化的方法研究逐渐增多，并且取得了一定的成果。Yu等[38]将骨髓来源的内皮祖细胞与成骨细胞联合培养，接种于多孔聚己酸内酯羟基磷灰石材料上，修复大鼠股骨0.8 cm缺损，发现联合培养组较单纯成骨细胞组形成了更多的毛细血管和骨组织。Koob等[39]将hBMSC联合人脐静脉内皮细胞（hUVEs）接种到经过脱钙处理的牛松质骨支架上，用来修复裸鼠颅骨缺损，结果显示单纯支架材料组和仅接种hBMSC组几乎没有形成新生血管，而hUVEs联合hBMSCs接种组和单纯hUVEs组都有一定量的新生血管生成，但是前者形成的血管明显多于后者，提示间充质细胞联合内皮祖细胞作为种子细胞确实能够提高组织工程骨的血管化。

使用自体的内皮祖细胞来促进组织工程骨的血管化，避免了排斥反应，操作较血管预置简单，而且形成与机体吻合的血管所用时间较短。研究发现，采用脂肪组织来源的内皮祖细胞联合MSCs植入裸鼠体内7 d后可以观察到功能性的血管连接[40]。随着内皮祖细胞对组织工程血管化及耐缺血等方面重要作用的逐渐揭示，有关内皮祖细胞和其他干细胞之间的信号传递及相互作用的研究也逐渐增多。

3 问题与展望

组织工程骨血管化的主要目标是使用安全可靠的、简单易行的方法，快速、充分地形成组织工程骨的功能性血供，最大程度地促进组织工程骨在体内的成活、矿化并成功修复骨缺损，使其长期存活而不被吸收。通过优化支架材料，改善支架材料的各项制备参数及工艺，可以制作出适宜血管长入的具有特定结构的支架，但优化后的支架植入体内后仍然需要机体的血管长入，所以仅从优化支架材料着手来增加组织工程骨的血管化是有其局限性的；促血管生长因子的促血管效果肯定，但是该方法在生长因子剂量控制和缓释技术方面还存在一定问题，局部的剂量不足或释放较快都不能够达到很好的效果，剂量过大时还容易出现血供压力较低、血管渗漏等情况[41]。基因转染技术解决了生长因子的长期释放问题，但是经过基因转染后的种子细胞的干细胞特性和细胞功能有可能受到影响，同时还要面临致癌和病毒感染的风险；血管预置技术通过外科手段直接建立起与机体的血供联系，效果可靠，但需承受手术的风险和创伤；联合骨髓来源的内皮祖细胞与种子细胞构建组织工程骨能够促进机体血管的长入，避免了异体脐静脉来源内皮祖细胞的免疫排斥反应，操作较简单，而且形成与机体吻合的血管所用时间较短，是一种很有前景的组织工程骨血管化方法，但是有关内皮祖细胞和种子细胞之间相互作用的机制研究仍然较少，缺乏相关的理论基础。未来的组织工程骨血管化策略将趋向上述多种方法的联合应用，集多种方法的优势于一体，增加成骨的质量和数量，从而有助于促进大段骨缺损的修复。

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Vascularization Strategy of Tissue Engineered Bone

WU Xiaowei,WANG Qian,CAO Yilin,XIAO Ran.Research Center,Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100144, China.Corresponding author:XIAO Ran(E-mail:xiaoran@pumc.edu.cn).

【Summary】The development of bone tissue engineering provides a promising way to repair large segment of bone defects. And it has already showed tremendous potential for application on the basis of numerous animal experiments and rising clinic studies.However,osteogenesis of the tissue engineered bone(TEB)grafts may be unstable after TEB constructs implanted in vivo,especially in sites with poor blood supply.Recent studies have demonstrated that the vascularization of TEB plays a vital role in generating large segment of bone grafts.In this article,the advances of TEB vascularization strategy were reviewed.

Tissue engineered bone;Bone defect;Vascularization

Q813.1+2

B

1673－0364（2015）05－0331－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.05.012

2015年3月20日；

2015年5月16日）

北京市科技计划重大项目（D090800046609003）。

100144北京市中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院研究中心。

肖苒（E-mail：xiaoran@pumc.edu.cn）。