乳腺癌基础研究与精准医学

赵建华， 唐金海

乳腺癌专题

乳腺癌基础研究与精准医学

赵建华， 唐金海

乳腺癌诊治的快速发展离不开基础研究的支撑。随着分子生物学技术尤其是高通量测序技术的发展，乳腺癌基因组研究逐渐成为研究热点，乳腺癌易感基因相继被发现，为新药开发提供有意义的靶点，促进了乳腺癌发病机制和预后研究，推动了乳腺癌精准医学的发展。作者就乳腺癌的高通量测序、遗传学、表观遗传学、药物基因组学，以及精准医学在乳腺癌诊治领域的应用前景进行了阐述。

乳腺癌； 高通量测序； 遗传学； 表观遗传学； 基因组学； 精准医学

乳腺癌诊治发展很快，但离不开基础研究的支撑。随着分子生物学技术尤其是高通量测序技术的发展，乳腺癌基因组学研究逐渐成为关注热点，乳腺癌易感基因和致癌位点相继被发现，为新药开发提供了有意义的靶点，同时促进了乳腺癌发病机制和预后的研究，有力地推动了乳腺癌精准医学的发展。

1 高通量测序

高通量测序技术是可以对数百万个DNA 分子进行同时测序，使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能的技术，也称为深度测序(deepsequencing) 或下一代测序技术(next generation sequencing，NGS)[1-2]。目前已经证实乳腺癌易感基因BRCA1/2与家族遗传性乳腺癌发病的关系较为密切，遗传性乳腺癌患者约90%发生BRCA1/2突变；这两个基因的共同特点是外显子特别大，突变遍布整个基因，且不同突变类型及位点对乳腺癌、卵巢癌的影响风险不同[3]。另外，在有乳腺癌家族史的女性中，仅有10%～15%的BRCA1/2突变携带者，约70%～80%的家族性乳腺癌患者的遗传原因仍有待于发现[4]。美国NCCN指南推荐BRCA突变检测的同时，还应考虑范围更广的其他基因检测如PTEN和P53等，并指出这种更广范围的基因检测是有证可循的。高通量测序技术为寻找癌症易感基因，科学和完整地考量基因标志，提供了一种新的平台。

1.1 全外显子组测序 是运用目标序列捕获技术和高通量测序只检测基因组外显子区域的新兴测序技术。利用外显子组测序对8 种常用的癌症细胞系进行分析，发现其对众多已知突变位点的分型结果与用Affymetrix SNP array 6.0 芯片的分型结果高度一致[5]。说明外显子组测序结果可靠，且相比于全基因组测序，全外显子组测序成本低、效率高，在疾病机制的研究中有相当的应用前景。近年来，利用全外显子组测序已经成功鉴定出乳腺癌的众多基因变异。新近一项研究对9例不携带BRCA1/2基因突变的早发性家族性乳腺癌患者进行了全外显子组测序，发现有2例患者携带RECQL基因突变[4]；进一步在另外439例家族性乳腺癌患者和1 588名对照组中筛选该基因，在病例组中又发现了7例该基因突变携带者，而对照组中只有1位，表明RECQL也是乳腺癌的易感基因，其突变可能参与了家族性乳腺癌的发生。

1.2 全基因组测序 随着全基因组测序成本的不断下降，其已成为癌症研究的最佳选择。Belkadi等[6]对全外显子测序和全基因组测序进行比较研究后认为后者在检测导致疾病发生的潜在基因突变方面更加强大，尤其是在单核苷酸位点变异(SNV)上。全基因组测序不但可以检测编码区和非编码区的点突变和插入缺失, 还可以在全基因组范围内检测拷贝数变异以及结构变异[7]。Bolze等分别用两种测序方法分析了6个不相关的个体，结果显示全外显子组测序在鉴定单核苷酸变异、插入和缺失突变检测方面劣于全基因组测序，且无法检出拷贝数变异。

1.3 单细胞基因组测序 无论全外显子组测序还是全基因组测序检测都是以大量细胞的混合DNA为样本，所获结果为一群细胞中信号平均值的分析，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，单个细胞独有的特性被忽视。单细胞测序技术的出现解决了组织样本测序时无法解决的细胞异质性难题[8]。Wang等[9]联合单细胞测序和标靶单细胞深度测序建立了一种称作nuc-seq的新测序方法，不仅能确认变异，还能精确的检测数千个细胞的变异频率。他们用该技术分别检测了雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌和三阴性乳腺癌的肿瘤细胞，未发现基因组是完全一致的肿瘤细胞，且三阴性乳腺癌细胞的突变率更高。另外，肿瘤化疗中一直存在的困惑“耐药突变是在化疗前就已经存在于肿块内的少量细胞中，还是响应化疗而诱发出现的”，该项研究表明化疗前肿块内可能就已存在大量的耐药突变。

1.4 全转录组测序 是指利用高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。利用该技术可以进行基因非编码区界定、可变剪切研究、低丰度新转录本发现、融合基因鉴定和编码序列单核苷酸多态性的研究等。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。相比较于芯片技术，全转录组测序技术灵敏度更高，能检测到低丰度表达的基因，检测到单个碱基的差异和对RNA表达的定量化研究；且测序成本比基因芯片低。测序得到的完整RNA序列，可用于发现新基因并进一步完成单个碱基水平和全基因组范围的生物信息学分析和基因功能的研究[10]。

2 传统遗传学

肿瘤的发生是基因突变逐渐积累的结果。通过上述各种类型基因组测序对个体或群体进行差异性分析，可快速找到与肿瘤发生发展及耐药相关的标记。

2.1 高风险人群筛检 有乳腺癌家族史的女性中，25%可检出高风险的基因标记如BRCA1、BRCA2、PTEN、TP53、CDH1和STK11，其携带者有80%的可能性会罹患乳腺癌；2%～3%可检出中度风险的基因标记如CHEK2、BRIP1、ATM和PALB2；每多携带一个标记，患乳腺癌的风险将增加2倍[11]。因此在高风险人群中筛检这些基因进行综合分析非常重要。

2.2 指导治疗 Ellis MJ等[12]利用全基因组测序分析新辅助化疗乳腺癌患者基因突变与芳香化酶抑制剂反应性的关系，发现TP53突变与芳香化酶抑制剂抵抗相关，而GATA3突变会增加患者对芳香化酶抑制剂的敏感性。虽然新一代测序技术发展很快且成本也在下降，但仍然难以开展此类研究——将基因数据和药物的反应性关联起来，其主要原因是因为临床上鲜有患者只用单一药物或一种化疗方案进行治疗，联合用药导致了基因和药物之间关系评估的复杂性。

2.3 药物靶标 HER2是乳腺癌治疗的重要靶标，HER2扩增/表达阳性的患者常用曲妥珠单抗、帕妥珠单抗和拉帕替尼等靶向药物治疗。Bose等[13]对来自8项乳腺癌基因组测序计划的25例HER2基因扩增阴性的患者进行研究，发现有7个HER2突变位点与来那替尼的敏感性相关，表明这些突变位点可作为来那替尼治疗的靶标。另外，靶向药物的疗效预测或评价也需要多因素逐渐细化的过程。 以HER2为例，对于HER2检测均显示为阳性的患者，其对靶向药物的反应可能并不相同，这说明可能存在与HER2有协同作用的分子，这些未知分子在不同患者间的差异导致了疗效的差别。需要把这些新分子找出来，分析其生物学特性，与HER2联合检测，以建立更科学和完整的评价手段，指导治疗[14]。

3 表观遗传学

癌症的发生不仅仅是基因缺陷的结果，表观遗传学修饰也发挥了重要作用。越来越多的证据表明，表观遗传学机制在乳腺癌中扮演了重要角色。DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰和微小RNA(MicroRNA，miRNA)调控是最重要的三种表观遗传学修饰，它们的变异能干扰靶基因表达，从而影响癌症的发生、发展及预后。

3.1 表观遗传标志 肿瘤表观遗传学在肿瘤的诊断中具有相当重要的意义。由于常规肿瘤标志物敏感性和特异性的不足，目前尚无理想的生物标志可用于乳腺癌的早期诊断。一些抑癌基因CpG岛甲基化已被当作肿瘤早期诊断的标志用于临床。Hocque等[15]研究了乳腺癌患者血清中4个基因(APC、GSTP1、RASSF1A和RARb2)的异常甲基化，发现至少有一个基因甲基化，其诊断乳腺癌的敏感性和特异性分别为62%和87%。检测特定基因的甲基化，不仅对乳腺癌有诊断意义，对乳腺癌的分子分型、危险性评估，以及化疗疗效分析和患者预后判断等都具有一定的价值[16]。

3.2 预防与治疗 乳腺癌是全世界女性中排名第一位的恶性肿瘤，主要的高发区是欧美国家，亚洲如日本和中国的发病率相对较低。流行病学调查分析认为可能与大豆的食用量有关，我国及日本等亚洲国家大豆消耗量是美国等西方国家的20倍；大豆抗癌的主要原因是因为大豆染料木黄铜可减少关键基因的甲基化并有组蛋白乙酰化修饰的作用。另外还有很多其他生物活性食品成分和营养物质可以改变乳腺癌表观遗传表现型。例如，红葡萄中的白藜芦醇、姜黄中的姜黄素和欧芹中的芹黄素等可影响DNA甲基转移酶活性；腰果中的漆树酸、大蒜和姜黄素等可影响乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶活性[16]。虽然已有甲基化药物进入临床试验阶段，但这些药物无基因特异性且存在毒副作用，目前仅用于部分肿瘤的联合用药中。如，第一个被美国FDA批准用于骨髓增生异常综合征的药物5-氮胞苷(5-aza-CR)与放射疗法联合治疗可抑制乳腺癌肿瘤细胞的生长[17]。不过需要注意的是，5-aza-CR不仅可以活化抑癌基因，同时也可以活化癌基因。因此，在目前无针对性逆转药物的情况下，通过生物活性食品的摄入来改变表观遗传表现型是增强乳腺癌化疗效果和降低肿瘤复发的最佳选择。

4 药物基因组学

多年以来，临床医生常根据乳腺癌患者的临床和病理特征来选择治疗方案，然而具有相似特征的患者在应用相同的化疗方案后结果却不尽相同。该差异一部分是由肿瘤生物学特性导致的如雌激素受体和HER2的表达情况，但同时药物代谢酶、药物转运蛋白、受体和其他药物靶体的基因多态性也与药物效应和毒性密切相关。因此，乳腺癌治疗方法的改进和发展在很大程度上取决于药物基因组学的研究与应用。

现代医学不再只注重预防和传统治疗，正向着安全有效和药物的经济治疗方向发展，并由此催生了药物的个体化治疗。这是一种基于个体的药物遗传学和药物基因组学信息，根据特定人群甚至特定个体的病情、病因以及遗传基因(SNP、单倍性、基因表达)，提供针对性治疗和最佳处方用药的新型疗法。药物基因组学研究的实质就是要发展个体化医疗手段，根据个体独特的基因型为每个患者配置最优化的药物，使药物疗效更高，毒性更低。从药物基因组学水平研究并获得适合于个体的治疗方案，有助于乳腺癌精确治疗的发展。

5 精准医学在乳腺癌诊治领域的应用前景

美国总统奥巴马在2015年1月20日的国情咨文中提出“精准医学计划”，希望以此“引领一个医学新时代”。早在十年前就已有精准医学的概念，随着分子生物学技术的发展，新一代测序技术的革新，生物信息学分析工具的出现推动了精准医学的发展。

5.1 液体活检(liquid biopsy) 被MIT Technology Review杂志评为2015年十大突破性技术。它不同于组织活检，指的是运用静脉血液样本替代肿瘤组织行病理学、分子生物学的检测手段，内容包括血浆循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，CtDNA)和循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)的检测；可以实时评估肿瘤在不同临床阶段的发展状况和生物学行为，指导临床个体化治疗。

CtDNA是由肿瘤细胞分裂或凋亡时释放到血浆中的单链或双链DNA，携带有与原发肿瘤组织相一致的分子遗传学改变。它的检测融合了血液标志(均一性好，可提供更完全的分子信息，而组织活检取材存在着肿瘤异质性)与组织标志(特异性高，携带肿瘤特有变异，而蛋白类标志检测会出现假阳性结果)的优点。Perkins G等[18]研究证实，从晚期肿瘤患者外周CtDNA中可成功检出肿瘤体细胞突变，与匹配的石蜡肿瘤组织样本检测结果完全吻合；说明在肿瘤活检不能反复进行时，可通过ctDNA来跟踪患者的预后情况。Dawson SJ等[19]研究认为ctDNA检测能够真实反映实体瘤组织中的基因突变图谱和频率，是治疗效果评价和治疗后临床随访的重要监测指标。Yong E等[20]研究则强调了ctDNA检测对肿瘤的实时监测效果，他认为ctDNA半衰期只有不到2小时，能更清晰的反映肿瘤的当前信息，而绝大多数蛋白标志能在血液中存在几个星期，等等。这些结果均提示CtDNA如果能得到充分的利用的话，必将为癌症治疗带来一场变革。

循环肿瘤细胞(CTCs)是指从实体瘤中脱落出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞；可出现在肿瘤进展的早期阶段，单个细胞或细胞集群并呈现部分或完整的上皮间质转化(EMT)表型。这些细胞随着血液循环流动，有可能会驻留于远处器官并且发展为临床可检测到的转移。Cristofanilli M等[21]研究证实，治疗前CTCs数目是转移性乳腺癌(MBC)患者无进展生存(PFS)和总生存(OS)的独立预测因子。Flores LM等[22]用FISH检测CTCs的HER2扩增情况，发现原发灶HER2表达与CTCs中存在不一致，CTCs表型分析具有更重要的临床意义，可为HER2靶向治疗提供有用信息。近年来也有技术实现了对CTCs进行单个细胞DNA测序，并且证实了对单个CTC进行二代测序的可行性[23]。对CTCs数目及其表型检测，以及CTCs体外药敏试验的分析将会为我们提供肿瘤的实时“液体活检”，为乳腺癌的治疗提供更多的信息，从而真正实现乳腺癌的个体化治疗。

5.2 个性化治疗 新一代测序技术引发靶向药物革命，推动个性化治疗时代的到来。癌症患者的液态活检和全基因组测序使得我们能够方便、实时、完整地了解乳腺癌基因组变异及其结构和表达状况，帮助我们找到大量的具有特征性的基因标志并发现新的药物靶点。靶向药物是目前治疗癌症的最先进的药物，可以选择性的在肿瘤组织内蓄积形成相对较高的浓度，在提高药效的同时抑制毒副作用，减少对正常组织、细胞的伤害。通过对患者进行已知癌症相关基因靶点的测序筛查，再根据筛查结果使用相应的分子靶向药物，具有高度的选择性和特异性。伴随着单细胞基因组测序技术的发展，化疗前我们可以预先对乳腺癌患者血液内肿瘤细胞的基因构成进行评估，获得肿瘤细胞携带的耐药突变信息，然后选择合适的化疗方案对患者进行化疗，使药物不良反应或抗药危险程度降到最低，疗效达到最大。

总之，分子生物学检测技术包括新一代测序技术和液态活检手段的发展对于肿瘤的临床医学研究具有重大的推动作用，使寻找新的肿瘤标志和癌症驱动基因成为了可能，这势必会影响乳腺癌的诊断和治疗，为乳腺癌的精准诊治打下了坚实的基础。

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210029 江苏 南京，江苏省肿瘤医院

赵建华，女，研究员，E-mail：jhzhao2838@sina.com

唐金海，男，教授，博导，主任医师，擅长乳腺癌的标准化治疗，E-mail：doctangjinhai@163.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2015.03.003

1674-4136(2015)03-0146-04

2015-06-14][本文编辑：李筱蕾]