体外震波对内皮细胞影响的研究进展*

左伟高福强孙伟**

（1.北京大学中日友好临床医学研究所；2.中日友好医院骨关节外科骨坏死与关节保留重建中心，北京100029）

体外震波对内皮细胞影响的研究进展*

左伟1高福强2孙伟2**

（1.北京大学中日友好临床医学研究所；2.中日友好医院骨关节外科骨坏死与关节保留重建中心，北京100029）

体外震波（extracorporealshock wave，ESW）是一种特殊形式的脉冲声波。当ESW以声能的形式在皮肤、肌肉、脂肪、韧带、肌腱及骨骼等具有不同声抗特性的介质界面传播时，产生不同的机械作用力。细胞可以感受各种力学刺激并将其转化为各种生物信号，从而影响细胞的增殖、分化、迁移、凋亡等生理功能[1]。ESW在临床已广泛应用于治疗足底筋膜炎、肱骨外上髁炎、肩关节钙化性肌腱炎、骨不连、股骨头缺血性坏死等疾病，并且临床和动物实验证实ESW具有抗炎、成血管、成骨、促进创面愈合等作用，然而ESW作用的具体机制还未完全阐明。

内皮细胞衬贴于血管的腔面，持续受到血液流动产生的各种力学刺激。内皮细胞能够感受各种力学刺激并将其转化为细胞内生化信号，调节控制细胞生理功能。与此同时也和许多疾病的发生发展相关[2]。因此机械力学作为外部信号如何影响内皮细胞生理功能的改变及机械力学导致的细胞内生化信号的转导机制成为近年的研究热点。机械力学刺激作用于内皮细胞通过激活力学感受器、信号传导通路、基因和蛋白的表达，调节内皮细胞生理功能。当内皮细胞受到具有固定方向的力学刺激（例如：动脉搏动性剪切力和单轴向拉伸力）时，只引起短暂的促炎症和促增殖通路分子信号的激活。当固定方向的机械刺激持续存在时，这些信号的传导都受到抑制。当受到没有固定方向的机械刺激（例如：血管分支、结构异常部位的湍流和相对无向拉伸力）时，将导致促炎症和促增殖通路分子信号的持续激活。因此内皮细胞对机械力学刺激的功能性反应，一方面构成其对生理功能控制调节的一个关键因素，同时参与许多血管相关疾病的发病因素[3-6]。

1 内皮细胞力学传导机制

研究表明细胞质膜上的胞质膜微囊，作为质膜上平台介导多种细胞功能，包括机械力学信号的传导[7]、血液流动和压力的改变导致胞质微囊部位蛋白磷酸化水平发生改变[8]。微囊蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）是微囊主要组成成分，Cav-1缺失的小鼠对机械刺激的生理反应缺失[9]。内皮细胞膜蛋白成分如离子通道、血管内皮细胞生长因子受体-2（vascular endothelial grow th factor receptor-2，VEGFR-2）、G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptors，GPCRs）能感受并且传导机械刺激。在剪切力作用下可诱导内皮细胞膜K+通道的开放[10]，并且导致舒血管物质的释放和基因的表达。同时研究表明剪切力导致钙瞬变[11]，而拉伸力导致内皮细胞非选择性阳离子通道的开放[12]。值得注意的是，机械刺激诱导的其他分子信号能够间接活化离子通道。研究表明：在机械刺激开始的1 s，能够激活内皮细胞特定G蛋白偶联受体，在机械刺激作用下通过GPCRs直接或间接活化G蛋白，进而引发细胞内磷酸化过程。细胞膜表面原纤毛也是内皮细胞的力学感受器之一，细胞实验证明，具有纤毛结构的内皮细胞比不具有纤毛结构的内皮细胞对剪切力反应更加强烈[13]。缺乏原纤毛的内皮细胞不能将机械刺激转化为内皮细胞内Ca2+和NO信号。

内皮细胞膜表面糖萼不仅作为一个屏障来限制分子和白细胞黏附到内皮表面，而且与内皮细胞力学传导相关。流体刺激调节糖萼的产生与分布[14]。当在剪切作用24 h后，糖萼的组成成分，如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、磷脂酰肌醇聚糖等，表达增加[15]。当用乙酰肝素酶去除糖萼后，流体刺激诱导的内皮细胞反应则显著下降[16]。

整合素是内皮细胞重要的力学感受器。在剪切力作用下，整合素与细胞外基质配体在黏附斑处的结合是信号通路传导的起始，并导致血管的舒张和血压的调节[17]。黏附斑激酶是黏着斑重要组成部分，并且是细胞内信号的传导者。机械性牵张力能快速

增加局部黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）的磷酸化。研究表明FAK参与循环牵张力和剪切力诱导的内皮细胞增殖、形态重构和炎性反应过程[18]。

2 ESW对内皮细胞作用机制基础研究

2..1 ESW ESW作用于细胞参数选择

根据震波产生的方式不同，可分为液电式、电磁式、电压式，按能量高低分为低能量ESW（0.1～0.001m J/mm2）和高能量ESW（＞0.2m J/mm2）。在应用ESW作用于体外培养细胞时通常采用低能量级，但作用的确切参数目前尚未有统一标准。

Ha等[20]使用能流密度为0.012～0.045m J/mm2的ESW 1000次作用于人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）时细胞形态、凋亡率、增殖率与对照组无明显差别。能流密度为0.09 m J/mm2作用1000次时，细胞死亡率很高，当达到0.016m J/mm21000次时，几乎所有细胞与培养皿底部分离并死亡。Takahiro等[19]将HUVECs分为四组，每组分别使用不同能流密度的ESW，分别为0.02、0.09、0.18和0.35 m J/mm2，每组各作用500次后，在相同条件下培养24 h，检测血管内皮生长因子（vascular endothelial grow th factor，VEGF）和fms样酪氨酸激酶（fins-like tyrosine kinase-1，FLT-1）mRNA的表达情况。结果显示：在能流密度为0.09m J/mm2的ESW作用500次时，VEGF和FLT-1的mRNA表达为最高水平。

Sansone等[21]将人微血管内皮细胞（humanm icrovascular endothelial cell，HMECs）分为两组，分别使用0.01和0.02m J/mm2的ESW，相同能流密度组按作用次数200和800划分小组。结果显示：0.01m J/mm2的ESW作用200次时ESW促血管生成作用最强。

Zhang等[22]在研究ESW作用于细胞最佳参数选择的实验中，将内皮组细胞分为5组。每组分别使用不同能流密度的ESW，同时每个大组又根据接受ESW作用次数的不同分为4小组，48 h后检测血管生成因子、凋亡因子、炎症介质、趋化因子的表达水平。结果显示：当细胞受到能流密度为0.04～0.13m J/mm2的ESW刺激作用时，血管生成因子的表达增加，而细胞的凋亡因子表达下降。当作用于细胞的ESW能流密度为0.16m J/mm2时，血管生成因子表达下降，细胞凋亡因子表达增加。当作用能量相同而次数不同时，表现出的作用趋势类似。作用次数相对少时，细胞因子的表达增加，凋亡因子的表达减少。作用次数多时，抑制细胞因子的表达且导致细胞的凋亡。由此推断：ESW作用于体外培养细胞最适宜参数为0.1～0.13m J/mm2，作用次数为200～300次。

2.2 ESW ESW促内皮细胞血管形成作用

在临床和活体实验中应用ESW表明，ESW具有促进血管形成作用。Zimpfer等[23]用ESW刺激小鼠心肌梗死模型心外膜，分别在第六周和第十四周通过组织学定量检测法显示，ESW能增加梗死心肌模型微血管密度。Stojadinovic等[24]用ESW作用于小鼠缺血皮肤模型，6 h后检测到血管生成因子的表达增加，并且在第4天和第7天之后观察到血管形成增加。Oi等[25]将ESW作用于缺血骨骼肌，28 d后观察到毛细血管密度的增加。根据上述描述，ESW作用于组织细胞促进血管形成的可能机制为ESW通过促进VEGF和一氧化氮（nitric oxide，NO）的表达增加促进血管形成。然而在Sansone等[21]用能流密度为0.01m J/mm2ESW 200次作用于3D基质培养模型中的HMECs，12 h后观察到毛细血管连接的显著增加，但在作用早期3 h并未检测到血管内皮生长因子（VEGF）和内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的表达增加，在作用后3 h检测发现，凋亡过程相关基因（BAX、BCL2LI、GADD45A、PRKCA）、细胞周期相关基因（CDKN2C、CEBPB、HK2、IRF1、PRKCA）、细胞黏附分子（ICAM-l）、癌基因（JUN、WNT1）表达下降。Nishida等[19]使用0.09m J/mm2的ESW 500次作用于HUVECs，24 h后观察到VEGF和FLT-1表达的显著增加。Zhang等[22]用0.012～0.045m J/mm2的ESW 1000次作用于HUVECs，发现ESW能激活磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、eNOS和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，Erk1/2）的磷酸化，并进一步证实ESW作用于HUVECs通过激活由VEGF-2、血小板-内皮细胞黏附分子（plateletendothelial cell adhesionmolecule-1，PECAM-1）和VE-钙黏着蛋白组成的机械感觉传导复合体，使PI3K、Akt、eNOS和Erk1/2发生磷酸化，继而导致血管内皮生长因子Akt、eNOS、KLF2、KLF4、MTI-MMP、MMP10、NP4A1的表达增加导致成血管效应。

2.3 ESW ESW作用于内皮细胞的抗炎症反应作用

ESW在临床成功应用于治疗肌肉结缔组织炎性疾病，例如足底筋膜炎、肱骨外上髁炎、肩关节钙化

性肌炎。ESW作用于机体产生抗炎作用的具体机制还未阐明，其可能机制为ESW促进细胞的NO生成增加。Mariotto等[26]用0.03m J/mm2的ESW 1000次作用于HUVECs，30m in后检测到eNOS活性增加，且用共焦显微镜和特殊的NO染色探针证实细胞内NO生成增加，并且当HUVECs与eNOS抑制剂（LNAME）共同培养时，NO的生成受到显著抑制，并通过使用ESW作用于脂多糖（LPS）或干扰素（IFN-γ）与HUVECs共同培养制作的细胞炎症反应模型，证实eNOS的激活导致NO生成的增加，抑制了核转录因子（nuclear factorκgene binding，NF-κB）的活化，由此抑制了炎症因子基因的表达，产生抗炎作用。

最近有文献报道，ESW的抗炎作用可能与模式识别受体（toll-like receptor 3，TLR3）的活化有关。TLR3是固有免疫系统的组成部分，参与识别来自病毒的双链RNA和DNA片段，并且能够探测到邻近细胞释放的细胞溶质RNA。Holfeld等[27]使用0.08m J/mm2的ESW 250次作用于HUVECs，后分别在2 h、4 h、6 h检测TLR3、CYP-B、CYP-A、IL-6、IL-10和VCAM的表达情况，推测ESW作用于HUVECs产生抗炎作用的可能机制为TLR3活化导致的炎症调节三阶段反应。第一阶段由IL-6介导促炎症反应阶段。第二阶段IL-10表达的逐渐增加并抑制IL-6介导的炎症反应阶段。第三阶段IL-10表达的持续增加，IL-6表达下降，炎症反应受到抑制阶段。

2.4 ESW ESW对内皮细胞的增殖、凋亡、迁移作用的影响

ESW在近些年来被用于治疗骨不连和骨坏死，成为骨科领域一个新兴的研究热点，最近又被用于治疗缺血性心肌疾病和下肢缺血性疾病，以促进局部组织血管新生。ESW促进组织血管再生的作用机制还未完全阐明。ESW作用于内皮细胞影响细胞的增殖、凋亡、迁移以至进一步影响血管的再生。Ma等[29]使用低能量体外震波（low-energy extracorporeal shock wave，LE-ESW）作用于小鼠，研究结果表明，LE-ESW通过激活内皮细胞一氧化氮合酶促进VEGF的表达增加，VEGF是参与血管化调控的主要生长因子，它可触发一系列的修复反应，能有效地促进血管内皮细胞增殖及迁移，促进新血管的形成。Hayashi等[30]使用0.26 m J/mm2的ESW 2000次作用于股骨头坏死动物模型，实验发现与对照组相比实验组VEGF在作用后第2、4、8、12周表达明显增加，且在停止使用ESW作用后实验组与对照组VEGF表达无明显差别。与此同时，实验组VEGF基因表达明显高于对照组。Sansone等[21]使用ESW作用于HMECs发现ESW可抑制内皮细胞的凋亡从而促进血管再生。然而在Ha等[20]的体外研究中使用0.012～0.045m J/mm2的ESW 1000次作用于HUVECs后检测内皮细胞的增殖和凋亡情况，发现ESW作用组与对照组无明显差别，但ESW作用组内皮细胞的迁移率显著高于对照组，显示ESW促进内皮细胞的迁移。

3 结语

组织细胞的生存不仅受到复杂的生化环境的影响，而且面临各种机械力学作用。机械力学刺激对细胞生理功能平衡的调节有重要作用，是组织生理平衡和某些疾病发生发展的关键[28]。内皮细胞在体内始终受到血液流体力学作用，机械力学作用对血管内皮细胞的生理功能以及相关疾病的发病机制有着十分重要的影响。体外震波作为一种新型非侵入性治疗方法，其在临床应用中的疗效取得了广泛的认可，其产生作用的具体机制还未完全阐明。体外震波作为一种特殊形式的机械力学刺激对内皮细胞的生理功能有重要影响。研究体外震波对内皮细胞产生作用的具体机制，对于某些与内皮细胞功能紊乱相关疾病的治疗有重要意义。

[1]Vogel V.Mechanotrasduction involving multimodular proteins:converting force into biochem ical signals.Annu Rev Biophys BiomolStruct,2006,35:459-488.

[2]Chien S.Mechanotransduction and endothelial cell homeostasis:the w isdom of the cell.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,292(3):H1209-1224.

[3]Reitsma S,Slaaf DW,Vink H,etal.Theendothelial glycocalyx:composition,functions,and visualization.Pflugers Arch,2007,454(3):345-359.

[4]Davies PF.Hemodynam ic shear stress and the endothelium in cardiovascular pathophysiology.Nat Clin Pract Cardiovasc Med,2009,6(1):16-26.

[5]Zaragoza C,Márquez S,Saura M.Endothelialmechanosensors of shear stress as regulators of atherogenesis.Curr Opin Lipidol,2012,23(5):446-452.

[6]Conw ay D,Schwartz MA.Lessons from the endothelial

junctional mechanosensory complex.F1000 Biol Rep, 2012,4:1.

[7]Zeng Y,Tarbell JM.The adaptive remodeling of endothelial glycocalyx in response to fluid shear stress.PLoS ONE, 2014,9(1):e86249.

[8]Radel C,Rizzo V.Integrinmechanotransduction stimulates caveolin-1 phosphorylation and recruitmentof Csk tomediate actin reorganization.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005,288(2):H 936-945.

[9]Yu J,Bergaya S,Murata T,etal.Directevidence for the role of caveolin-1 and caveolae inmechanotransduction and remodeling of blood vessels.J Clin Invest,2006,116(5): 1284-1291.

[10]Olesen SP,Clapham DE,Davies PF.Haemodynamic shear stress activates a K+current in vascular endothelial cells. Nature,1988,331(6152):168-170.

[11]Schwarz G,CallewaertG,DroogmansG,etal.Shear stressinduced calcium transients in endothelial cells from human umbilical cord veins.JPhysiol,1992,458:527-538.

[12]Popp R,Hoyer J,Meyer J,etal.Stretch-activated non-selective cation channels in the antilum inalmembrane of porcine cerebral capillaries.JPhysiol,1992,454:435-449.

[13]Hierck BP,van der Heiden K,Alkemade FE,etal.Primary cilia sensitize endothelial cells for fluid shear stress.Dev Dyn,2008,237(3):725-735.

[14]Yao Y,Rabodzey A,Dewey CF Jr.Glycocalyx modulates themotility and proliferative responseof vascularendothelium to fluid shear stress.Am JPhysiol Heart Circ Physiol, 2007,293(2):H1023-H1030.

[15]Zeng Y,Tarbell JM.The adaptive remodeling of endothelial glycocalyx in response to fluid shear stress.PLoS One, 2014,9(1):e86249.

[16]MochizukiS,Vink H,Hiramatsu O,etal.Roleof hyaluronic acid glycosam inoglycans in shear-induced endotheliumderived nitric oxide release.Am JPhysiol HeartCirc Physiol,2003,285(2):H722-H726.

[17]Frame MD,RiversRJ,A ltland O,etal.Mechanisms initiating integrin-stimulated flow recruitment in arteriolar networks.JAppl Physiol(1985),2007,102(6):2279-2287.

[18]Zebda N,Dubrovskyi O,Birukov KG.Focal adhesion kinase regulation of mechanotransduction and its impact on endothelial cell functions.M icrovasc Res,2012,83(1):71-81.

[19]Nishida T,Shimokaw a H,Oi K,et al.Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo.Circulation, 2004,110(19):3055-3061.

[20]Ha CH,Kim S,Chung J,etal.Extracorporeal shock wave stimulatesexpression of theangiogenic genesviamechanosensory complex in endothelial cells:mimetic effect of fluid shear stress in endothelial cells.Int JCardiol,2013,168 (4):4168-4177.

[21]Sansone V,D'Agostino MC,Bonora C,et al.Early angiogenic response to shock waves in a three-dimensionalmodel of humanm icrovascular endothelial cell culture(HMEC-1).JBiol RegulHomeost Agents,2012,26(1):29-37.

[22]Zhang X,Yan X,Wang C,et al.The dose-effect relationship in extracorporeal shock wave therapy:the optimal parameter for extracorporeal shock wave therapy.JSurg Res, 2014,186(1):484-492.

[23]Zimpfer D,Aharinejad S,Holfeld J,etal.Direct epicardial shock w ave therapy improves ventricular function and induces angiogenesis in ischem ic heart failure.JThorac Cardiovasc Surg,2009,137(4):963-970.

[24]Stojadinovic A,Elster EA,Anam K,et al.Angiogenic response to extracorporeal shock wave treatment in murine skin isografts.Angiogenesis,2008,11(4):369-380.

[25]Oi K,Fukumoto Y,Ito K,etal.Extracorporeal shock wave therapy ameliorates hindlimb ischem ia in rabbits.Tohoku J Exp Med,2008,214(2):151-158.

[26]Mariotto S,Cavalieri E,Amelio E,et al.Extracorporeal shock w aves:from lithotripsy to anti-inflammatory action by NO production.Nitric Oxide,2005,12(2):89-96.

[27]Holfeld J,TepeköylüC,Kozaryn R,etal.Shockwave therapy differentially stimulates endothelial cells:im plications on the control of inflammation via toll-Like receptor 3.Inflammation,2014,37(1):65-70.

[28]Huang H,Kamm RD,Lee RT.Cellmechanics and mechanotransduction:pathways,probes,and physiology.Am J PhysiolCell Physiol,2004,287(1):C1-C11.

[29]Ma HZ,Zeng BF,Li XL.Upregulation of VEGF in subchondral bone of necrotic femoral heads in rabbitswith use of extracorporeal shock waves.Calcif Tissue Int,2007,81 (2):124-131.

[30]Hayashi D,Kawakam iK,Ito K,et al.Low-energy extracorporeal shock wave therapy enhances skin wound healing in diabeticm ice:a critical role of endothelial nitric oxide synthase.Wound Repair Regen,2012,20(6):887-895.

2095-9958（2015）04-0 187-04

10.3969/j.issn.2095-9958.2015.02-020

国家自然科学基金面上项目（项目编号：81372013）；中日友好医院面上项目（项目编号：2013-MS-27）；中日友好医院青年科技英才计划（项目编号：2014-QNYC-A-06）

**通信作者：孙伟，E-mail:sun887@163.com