软骨组织工程种子细胞获取培养及鉴定研究进展

2015-01-21 13:24:38吕顺周军杰谢晓涛陈贤奇高文武刘铖张磊
中国骨与关节杂志 2015年11期
关键词:共培养充质胶原

吕顺 周军杰 谢晓涛 陈贤奇 高文武 刘铖 张磊

.综述 Review.

软骨组织工程种子细胞获取培养及鉴定研究进展

组织工程;间质干细胞;骨生成;胶原 II 型;种子细胞

骨关节炎是全球范围内最常见的疾病之一,其病变部位产生的疼痛、肿胀、肌肉萎缩等功能障碍严重影响着患者的生活质量。关节软骨缺损被公认为是骨关节炎发病的早期病理表现,保护和修复缺损的关节软骨成为早期干预骨关节炎的主要措施[1-2]。关节软骨损伤后自我修复能力有限,传统外科修复关节软骨的方法主要包括软骨下钻孔、磨削术和微骨折术等手段,但这种“以创伤修复创伤”的治疗模式临床效果并不理想[3]。近年来运用组织工程学技术修复关节软骨缺损成为干预骨关节炎研究的热点。软骨组织工程主要包括种子细胞、支架材料和培养环境三大要素[4-5],种子细胞的获得培养及鉴定是整个组织工程学的基础,选择一种具有多向分化能力、免疫原性低、来源广的种子细胞显得尤为重要。现就软骨组织工程种子细胞的获取培养及鉴定的研究进展综述如下。

一、软骨组织工程种子细胞的获取来源

1. 关节组织中获取关节软骨细胞:最初研究者采用软骨细胞作为种子细胞,软骨细胞是关节软骨组织中的细胞成分,能分泌 II 型胶原和蛋白聚糖等细胞外基质[6]。自 1967 年 Manning 等[7]提出通过胰蛋白酶和细菌胶原酶联合消化法分离软骨细胞,软骨细胞的体外分离培养方法不断完善发展。王朝强等[8]应用胶原酶、胰酶制定了 8 种消化方法获取幼犬关节软骨细胞,通过 MTT 比色法、甲苯胺蓝染色及 II 型胶原免疫组织化学染色法等手段对所获得软骨细胞数量及细胞成活率进行检测分析,得出单纯应用 II 型胶原酶获得软骨细胞数量最多,且 5 代以内软骨细胞保持良好的细胞形态及表型。闫虎等[9]在此基础上采用II 型胶原酶消化并机械吹打的方法,获取培养 4 周龄新西兰大白兔膝关节软骨细胞,形态学观察发现:原代软骨细胞培养后 6 h,贴壁生长,培养后 72 h 形成单层,培养后96 h 可传代培养;MTT 法检测前 3 代软骨细胞表型稳定。王林林等[10]、刘小荣等[11]及耿书国等[12]采用相同的方法均可获得稳定增殖的软骨细胞,即机械-酶消化法可建立软骨细胞分离及培养体系。此种分离获取软骨细胞方法同样适用人类软骨细胞,唐新等[13]和童迅等[14]采用两步酶消化法 (胰蛋白酶+II 型胶原酶)分别取全膝置换术患者和创伤性截肢患者膝关节软骨分离培养,通过上述方法检测得出此种方法可得到纯度较高的软骨细胞,传代 4 代以内人类软骨细胞表型及生物学特性稳定,可用于实验研究。直接在软骨组织中获取软骨细胞方法虽简便易行,但其作为种子细胞应用于软骨组织工程存在一定缺陷,如来源少、增殖能力有限、体外长时间培养易发生去分化现象等。因此从软骨组织中直接获取软骨细胞作为种子细胞并不理想。

2. 干细胞的诱导获取种子细胞研究:具有无限或较长时间自我更新和多向分化能力的干细胞,克服了成熟软骨细胞的缺点。根据来源和个体发育过程中出现的先后次序不同,干细胞可分为胚胎干细胞、成体干细胞和诱导性干细胞。间充质干细胞 (mesenchymal stem cells,MSCs)是骨髓一种成体干细胞,具有干细胞共性。由于它具有向骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱等组织分化的潜能,且具有取材方便对机体无害、取自自体无免疫反应等优点[15]。因此以骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)为主的成体干细胞逐渐被研究者关注,利用BMSCs 或脂肪来源间充质干细胞构建组织工程软骨修复软骨缺损成为研究热点[16]。谭荣邦等[17]采用全骨髓培养+贴壁纯化法分离培养 BMSCs,经流式细胞仪鉴定为 BMSCs后,以转化生长因子 β1 (transforming growth factor β1,TGF-β1)、胰岛素样生长因子 1 (insulin-like growth factor 1,IGF-1)作为诱导因子诱导 BMSCs 定向分化为软骨细胞,II 型胶原免疫化学染色法鉴定诱导后细胞呈阳性,光镜及电镜下显示诱导后细胞细胞器丰富,胞核增大,核仁增多。提示诱导后的 BMSCs 具有软骨细胞表型,细胞分化代谢旺盛。毕晓娟等[18]及朱寅等[19]取吸脂术后脂肪组织分离培养人脂肪间充质干细胞并鉴定,采用三维培养法和添加诱导培养基进行诱导,阿利辛蓝染色及苏木精-伊红染色进行组织学分析,免疫荧光检测 II 型胶原表达,结果经诱导的脂肪间充质干细胞可表达大量糖胺多糖及 II 型胶原,具有软骨细胞的特性。刘晓潭等[20]取昆明种雄性小鼠附睾处脂肪,分离获取脂肪干细胞并进行细胞表型鉴定,经诱导后行甲苯胺蓝染色,番红 O 染色,II 型胶原免疫组织化学检测呈阳性,证实从脂肪组织中可分离到具有分化潜能的干细胞,经诱导后可分化为软骨细胞,具有来源广泛,取材方便等优点,可成为组织工程理想的种子细胞。诱导性多能干细胞 (induced pluripotent stem cell,iPSC)是通过体外基因转染技术将已分化的成体细胞重编程所获得的一类干细胞,iPSC 具有 ESC 的全能性[21]。刘康等[22]通过全骨髓贴壁分离法体外分离、扩增兔 BMSCs,利用腺病毒载体将生长分化因子 5 (growth and differentiation factor 5,GDF5)基因导入 BMSCs,采用番红-O 染色和甲苯胺蓝染色检测糖胺聚糖和蛋白聚糖、RT-PCR 和免疫化学染色检测软骨细胞特异性 Collagen II 和 Aggrecan 基因和蛋白表达,发现 GDF5 腺病毒感染的 BMSCs 细胞外基质糖胺聚糖和蛋白聚糖的含量显著增加,软骨细胞特异性 Collagen II和 Aggrecan 基因和蛋白表达升高,表明基因导入 GDF5 可促进脂肪间充质干细胞的成软骨分化。与 ESC 不同,iPSC的获取人们可以在不损毁胚胎或不用卵母细胞的前提下制备用于疾病研究或治疗的 ESC 样细胞。这样不仅成功地避免了长期以来争论不休的伦理问题的困扰,也为获得具有患者自身遗传背景的 ESC 样细胞增加了新途径。

然而,进一步研究发现将 BMSCs 分化获得的软骨细胞移植至裸鼠皮下存在“血管化”、“骨化”等问题[23-24]。而目前发现,部分组织中的成体干细胞不仅可以向自身组织进行分化,也可以向无关组织类型的成熟细胞进行分化,这种现象被称为转分化[25-26]。近来有研究报道,软骨组织中存在一群具有干细胞特性的细胞,可能成为软骨缺损修复的理想种子细胞[27]。薛珂等[28]利用纤维连接蛋白黏附法分别从猪耳软骨、关节软骨以及椎间盘软骨中分离培养干细胞,采用倒置相差显微镜及流式细胞仪技术对其进行干细胞特性鉴定,并进行成骨、成软骨、成脂的定向分化诱导,成软骨诱导后,3 种亚型软骨组织来源干细胞 Aggrecan、II 型胶原基因相对表达量高于 BMSCs (P<0.05)。提示不同亚型的猪软骨组织中均存在软骨干细胞,具有干细胞的典型特征。这种转化的分子机制一旦被阐明,就有望利用患者自身健康组织的干细胞,诱导分化成可替代病变组织功能的细胞来治疗疾病,这样既克服了由于异体细胞移植而引起的免疫排斥,又避免了胚胎干细胞来源不足以及相应的社会伦理问题。因此转分化的发现在干细胞研究中具有革命性意义,它为干细胞组织工程在临床治疗中广泛应用奠定了基础。

3. 干细胞与软骨细胞的共培养:国内外研究均已证实干细胞在特定生长因子刺激下可向软骨细胞定向分化,但此方法需要较多的种子细胞及昂贵的生长因子。机体内干细胞向软骨细胞分化是众多生长因子共同作用的结果,体外单一生长因子诱导形成的软骨细胞难免与体内分化形成的软骨细胞存在差异。因此,近年来共培养技术在组织工程研究中运用广泛,且已有相关研究应用动物来源的细胞分泌的细胞因子诱导人源干细胞向特定细胞分化[29-30]。郑朋飞等[31]将人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞按照 2∶1或 3∶1 的比例共培养,并用 100 μg / L 的胰岛素样生长因子 1 进行诱导。诱导后 14 天,运用 RT-PCR 检测聚集蛋白和 II 型胶原 mRNA 的表达,Western blot 检测聚集蛋白和 II 型胶原蛋白的表达,发现以 3∶1 共培养时 II 型胶原蛋白及聚集蛋白多糖蛋白表达更明显,得出人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞共培养后可诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化,且按 3∶1 的比例共培养可获得更多的软骨细胞。张瑾等[32]将微囊化的第 2 代兔软骨细胞与第3 代兔 BMSCs 按 1∶1 比例在 Transwell 小室进行共培养作为实验组,将干细胞与第 2 代兔软骨细胞共培养于Transwell 小室作为对照组,以及干细胞培养组作为空白组,经检测发现对照组增值率低于实验组和空白组 (P<0.05),实验组较其它两组糖胺聚糖和 II 型胶原蛋白水平均高 (P<0.05),表明微囊化软骨细胞与 BMSCs 共培养,可成功诱导 BMSCs 定向分化,诱导效果优于传统方法。共培养技术能够使软骨细胞快速增殖,从而减少软骨细胞的用量,避免了为获取足够量的软骨细胞反复传代培养而引起的软骨细胞老化和去分化,因此 BMSCs 和软骨细胞共培养对优化和扩大种子细胞源可能是一种实用的策略。

二、软骨组织工程中种子细胞的培养及鉴定

1. 软骨组织工程中种子细胞的培养方法:组织工程种子细胞的培养除了必要的培养基质及生长因子外,同时必须与支架材料具有良好的相容性[33-34]。国内外研究发现人脐带 Wharton 胶富含透明质酸、糖胺多糖及胶原等,还包含很多生长因子诸如胰岛素生长因子和其它细胞外基质蛋白。高钺等[35]用差速离心法制作人脐带 Wharton 胶细胞外基质 (hWJECM),制成 0.5% 浓度铺于培养板中形成 1 mm厚的薄膜作为实验组,单纯培养液组作为空白对照组,经倒置显微镜观察、甲苯胺蓝染色及 CCK 检测发现实验组增殖情况优于对照组,证实 hWJECM 免疫原性低,无细胞毒性作用,适宜软骨细胞培养。詹兴旺等[36]采用冷冻干燥法将质量分数为 2% 胶原与 3% 壳聚糖混合制备胶原-壳聚糖多孔支架,并将第 2 代兔软骨细胞接种到支架上,培养后 2 周检测细胞增殖率、蛋白聚糖及 II 型胶原 mRNA 表达均优于对照组,得出质量分数为 2% 胶原与3% 壳聚糖的混合支架适合软骨细胞生长增殖,可作为一种良好的修复和重建软骨载体。同时还有其它的技术应用于软骨组织工程中软骨细胞的培养,如为载体技术[37]、微重力条件[38]及细胞衍生的细胞外基质支架等技术[39]。随着科学工学技术的不断发展,3 D 打印技术不断应用于医学各个领域[40]。国内外已有研究将 3 D 打印技术应用于软骨组织工程中,通过 3 D 打印技术制作具有特定形态的骨软骨一体化支架,接种种子细胞并培养成为具有特定形态的骨软骨一体化再生支架组织,用于体内实验研究[41-42]。

2. 软骨细胞的鉴定:

(1)倒置显微镜观察软骨细胞形态:倒置显微镜观察原代软骨细胞呈圆球形,细胞悬浮后 24 h 大部分可贴壁。贴壁后细胞形态呈梭形或三角形或多角形,胞浆内可见折光的颗粒,周围有细长的突起,核明显呈圆形或椭圆形,核仁清晰。细胞悬浮后 1 周即可长满瓶壁,镜下观察可呈明显的“铺路石”状外观。随着传代次数的增加,梭形细胞增多,分泌和增殖能力下降,传代周期延长[43-44]。

(2)软骨细胞特异性标志物鉴定:软骨细胞作为关节软骨中的细胞成分,软骨基质中主要包括无定型基质和包埋于基质中的胶原纤维构成。无定型基质中主要为 3 种糖胺聚糖分子结合于核心蛋白形成大分子聚集蛋白聚糖,关节软骨中的纤维主要是由 II 型胶原蛋白组成的胶原原纤维,含量约为软骨基质的 40%。

a. 甲苯胺蓝染色:甲苯胺蓝染色可作为软骨细胞的特异性染色,其原理是软骨细胞分泌的蛋白聚糖经甲苯胺蓝染色显色为异染的蓝紫色。正常原代软骨细胞的甲苯胺蓝染色可见细胞内有蓝紫色异染颗粒,并且有少量的异染颗粒出现在细胞周围,集落样生长区域和多层生长区域的软骨细胞这一表现尤为明显,异染颗粒呈紫红色可以出现在部分细胞内及细胞外基质中,经多次传代培养后,软骨细胞甲苯胺蓝染色正染呈浅蓝色[45]。

b. II 型胶原免疫组化染色:II 型胶原被认为是软骨细胞最特异的表面标记之一,是软骨细胞诱导分化过程中特异性蛋白。可通过 II 型胶原免疫组化染色特异性鉴定软骨细胞,阳性反应是软骨细胞的胞浆被染成棕黄色,胞核不着色。细胞经传代后,棕黄色着色渐减弱[46]。

总之,利用软骨组织工程手段修复关节软骨缺损为临床干预骨关节炎提供新的思路和方法,种子细胞的老化和缺乏是限制软骨组织工程加速发展的瓶颈的问题。笔者通过综述软骨组织工程种子细胞获取来源及鉴别,希望为今后开发和挖掘更多的种子细胞源提供理论基础。通过查阅国内外文献发现,目前软骨组织工程种子细胞获取来源主要来自于自体软骨细胞、各种来源的成体干细胞、诱导性干细胞以及共培养获得的软骨细胞。随着研究的不断深入已基本解决前期所面临的问题,如种子细胞数量少、免疫问题及细胞表型不稳定等。但还有较多问题需要解决,如:安全性问题、效率问题及远期效果的问题。相信通过对种子细胞的进一步纯化以及培养条件的进一步优化,一些新技术手段应用如共培养技术、3 D 打印技术应用于软骨组织工程中,一定可以培养出可移植于体内的具有特定形态骨软骨一体化再生组织,用于解决关节软骨损伤这一医学难题。

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(本文编辑:李贵存)

Research of obtaining and identification of seed cells in cartilage tissue engineering

ZHOU Jun-jie, Email: boysroger@126.com

ObjectiveTo review the sources, cultivation and identifcation of seed cells in cartilage tissue engineering. MethodsRelated basic research literature on obtaining seed cells in cartilage tissue engineering was reviewed and analyzed, while repeated research was removed. ResultsChondrocytes could be induced and differentiated from animal carticular chodrocytes, mesenchymal stem cells (MSCs), induced pluripotent stem cells(iPSCs)and cartilage stem mesenchymal stem cells, which were proved to have typical chondrocyte characteristic and good biological characteristics. ConclusionsThese discoveries are lack of in-depth understanding on the exact mechanism that inducing factors induce differentiation of seed cells into chondrocytes. It remains to be articulated how the mechanism operates on inducing differentiation between cells and how to culture regenerated cartilage with characteristic morphology through 3-D printing and cartilage tissue engineering integration. Exploration of the underlying mechanisms will facilitate scientifc progress for the clinical treatment of osteoarthritis and other related diseases.

Tissue engineering;Mesenchymal stem cells;Osteogenesis;Collagen type II;Seed cells

10.3969/j.issn.2095-252X.2015.11.008

Q813

国家中医药管理局中医药重点学科建设项目 (NO.2013QK20);上海中医药大学研究生“创新能力培养”专项科研项目 (NO.2015YCX14)

200062 上海中医药大学附属普陀医院骨科

周军杰,Email: boysroger@126.com

2015-09-10)

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