低氧诱导成体干细胞血管化

王 琼 综 述 卢慕峻 审 校

低氧诱导成体干细胞血管化

王 琼 综 述 卢慕峻 审 校

组织工程和再生医学的发展，给组织器官功能修复提供了新的治疗方法。但是，在病理条件下，移植干细胞极低的生存率严重限制了干细胞功能的发挥。因此，体外低氧预处理诱导成体干细胞血管化，成为改善成体干细胞抵御缺氧、疾病等的可能方案。我们对低氧诱导成体干细胞血管化中不同诱导条件，及不同成体干细胞的优缺点的相关研究进行综述，以寻找较为理想的诱导血管化方案。

低氧成体干细胞血管化

机体正常功能状态的保持依赖于适宜的氧气供给，软组织损伤后，周围的微环境因血供减少而处于低氧状态。因此，软组织修复过程中血管生成具有十分重要的作用，缺氧状态被认为是血管发生的一种重要的刺激因素。

血管生成过程极其复杂，多种细胞因子，如VEGF、PGDF及TGF等，均参与其中，包括了内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。一般情况下，血管内皮细胞（Endothelial cell，EC）生长期有限，经多次传代后形态及生物学特性会有所改变，不宜长期传代培养。成体干细胞具有多向分化能力，不受传代限制，而备受瞩目。

实验证明，干细胞可以促进缺血组织的血管化[1-2]。低氧条件引起成体干细胞血管化的机理，一是成体干细胞通过氧化还原代谢及旁分泌内分泌等途径促进血管化，二是成体干细胞直接分化为与血管化相关的EC及血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）等。大量研究表明，低氧条件能够上调细胞缺氧诱导因子-1（Hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）的表达，而HIF-1通过调节促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）及VEGF等编码基因，而调控血管生成的过程[2-5]。近期研究表明，低氧条件可以促进SDF-1的受体CXCR4及CXCR7表达上调，增加其对SDF-1的敏感性[6-8]。相同氧分压条件下，不同成体干细胞促进分化的趋势是有差别的，同种干细胞在不同氧分压条件下的分化及增殖趋势也是不同的[9]。

1 骨髓间充质干细胞（BMSC）

BMSC是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有多向分化潜能，体内BMSC微环境的氧气浓度为1%~2%[10]，低氧环境对BMSC生存及功能维持起重要作用[11]。D'Ippolito等[12]发现，随着氧气浓度的降低，BMSC的增殖能力逐渐增加；Ziegelhoeffer等[13]发现，BMSC在生理或病理条件下并不能参与血管形成，只是作为一个支持细胞旁分泌的相关细胞因子作用于缺血组织；Kinnaird等[5]发现，移植BMSC后的小鼠主要是由BMSC旁分泌相关细胞因子促进损伤组织的血管化，而并没有观察到干细胞分化形成EC；而Al-Khaldi等将BMSC移植至小鼠损伤模型，发现BMSC可以分化为CD31阳性的血管内皮细胞（EC），损伤组织镜下可观察到血管样组织[14]。Annabi等[15]将BMSC接种于人造三维胶质膜上培养4 h后发现，1%低氧条件产生的三维毛细血管样结构比常氧条件多了约4倍，相关HIF-α、VEGF及其受体Flk-1、成纤维细胞生长因子（bFGF）等基因表达上调，证明了低氧条件可以迅速促进血管化。

相关研究发现，低氧能够诱导BMSC的SDF-1受体CXCR4及CXCR7的表达上调，并影响VEGF、HIF-1α及活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的表达[7-8，16]；SIRT1基因在低氧条件下具有重要的调节BMSCs增殖及分化的作用，它能够调节HIF-1α的表达[4，17]；Annabi等[15]发现，MT1-MMP蛋白的催化结构域受抑制可以强烈阻止干细胞形成毛细血管样结构，而低氧条件下能够诱导MT1-MMP基因过表达，说明MT1-MMP基因可能与低氧诱导干细胞血管化有关；同时，低氧引起MMP-2基因表达下调，而MMP-2基因与干细胞血管化之间的关系仍不清楚。

综上所述，我们可以推测，在生理状态下，组织损伤后，血液中本身存在的血管内皮祖细胞或者原位的血管内皮祖细胞分化为EC，而BMSC仅作为一种支持细胞通过旁分泌及内分泌等途径促进损伤组织血管化。体内试验中，对于移植到小鼠缺血模型的BMSC，其促进血管化的机理有两种可能，一是BMSC通过旁分泌内分泌等途径而促进血管化，二是BMSCs直接分化为与血管化相关的血管内皮细胞及血管平滑肌细胞等。而究竟是何种机理占主导作用，仍需要进一步探索。体外实验中，单纯低氧条件可以迅速促进BMSC血管化，但BMSC数量与骨髓中总细胞数之比约为1/100 000~ 1/25 000[18]，且年龄越大，BMSC的数量越少[19]。来源较少在一定程度上限制了BMSC的临床应用。

2 脂肪间充质干细胞（ADSC）

ADSC是脂肪组织中一类多能性干细胞，小鼠体内ADSC的微环境氧气浓度为3%[20]。不同位置的脂肪细胞，在解剖、生理及细胞水平上是不同的[21]；间充质干细胞有多种亚型，不同亚型的干细胞功能也是有差异的[22]。Barros等[23]利用缺氧鼠模型，通过肌肉注射将低氧预处理的ADSC植入损伤组织，结果发现高龄组鼠的血液灌流较对照组多了1.4倍，而年轻组的却少了1.2倍，免疫荧光证明ADSC并没有分化成血管内皮细胞的能力；人体内试验发现低氧处理24 h的ADSC并不能促进低年龄组（20~35岁）损伤组织的血管化。大量体外研究证明，单纯低氧条件不能诱导ADSC分化为EC，却能促进其VEGF、HIF-1α等的表达[23-26]，而ADSC促进血管化也绝不仅仅是VEGF的单独作用[5，25]；刘林奇等[27]发现，低氧条件下VEGF及bFGF的表达增高，而HGF表达却没有变化；单纯低氧条件与常氧条件处理ADSC相比，EC特征性免疫标记CD31及FLK-1的表达没有显著变化[6]；1%氧浓度下，ADSC具有更强的抵御缺氧等恶劣微环境的能力[24]。

相关研究表明，低氧条件可以促进脂肪干细胞SDF-1的受体CXCR4表达上调，增加其对SDF-1的敏感性[6]；Barros等[23]发现，低氧能够促进ROS的产生，进而引起VEGF等表达上调，从而促进其血管化。Jiang等[28]发现，HIF-1α、VEGF及BNiP3的表达随着氧浓度的下降而逐渐升高，而在1%氧浓度下，其值达到最高，但BNiP3被认为与细胞凋亡密切相关，而Bcl-2作为一个原癌基因，其表达在3%氧浓度时最高。

综上所述，无论体内或体外实验，单纯低氧不能诱导ADSC分化为EC，但能够促进其相关细胞因子的表达，从而促进血管化。ADSC取自脂肪组织，来源较广，容易获得，但相比BMSC，其促血管化能力较低。

3 其他类型的成体干细胞

人羊膜间充质干细胞（Human amniotic mesenchymal stromal cells，hAMSC）多取自于产后的胎盘组织，基本不存在伦理争议。hAMSC有分化为内皮细胞的能力[29]，相比ADSC和BMSC，hAMSC拥有更强的增殖能力[30]。小鼠体内实验发现，将来自人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUMSC）的微囊泡移植到缺血损伤的肾组织，能够改善缺血肾脏组织的损伤程度，有明显抗炎抗纤维化的组织修复作用，但其抵抗损伤、促进修复的具体机制仍不清楚[31]。目前，有关低氧诱导hAMSC、hUMSC及其他类型成体干细胞的研究相对较少，但其优越的增殖分化能力有可能使其成为将来的研究热点。

4 低氧条件

不同的氧浓度对同一种成体干细胞的增殖分化能力有不同的影响[6，28]；相同氧浓度作用不同时间，其影响亦不尽相同[25]。研究发现，5%氧浓度预处理的ADSC增殖能力下降，但却有向软骨细胞分化的趋势[32]；Rasmussen等[25]发现，相比1%氧气条件和常氧条件，在5%的氧气条件下，ADSC拥有更高的增殖能力，而其在1%氧气条件下细胞死亡率更高；Jiang等[28]认为，3%的氧浓度为ADSC体外培养的最佳低氧条件；Barros等[23]使用0.5%氧浓度预处理皮下脂肪组织24 h，能够逆转因高龄引起的ADSC分化为EC能力降低的问题；Rasmussen等[25]延长低氧作用于ADSC的时间，可以增加其VEGF的表达；Thangarajah等[6]在体外不同氧浓度（21%、5%及1%）及不同时间（1、2、3 d）培养预处理ADSC，结果发现氧浓度越低、培养时间越长，VEGF的表达越高。

对于诱导成体干细胞血管化的最佳低氧浓度，目前仍存在较大争议，但可以确定成体干细胞血管化的能力与低氧作用的时间呈正相关。

5 培养方式

Hamou等[1]将加入50 ng/mL VEGF的培养基培养ADSC 5 d（2.5%的氧浓度下）后发现DiI-acLDL（血管内皮祖细胞标志物）阳性细胞，常氧条件下BMSC与bEND.3细胞共培养5 d后发现CD31阳性细胞，证明了VEGF及细胞共培养可以促进BMSCs及ADSCs向血管内皮细胞的分化。Thangarajah等[6]在体外培养ADSC，对比常氧组、单纯低氧组、低氧+VEGF组与低氧条件bEND.3细胞共培养组的ADSCs血管化能力：低氧组较常氧组VEGF表达增高，但CD31及FLK-1表达（EC相关）没有显著变化，低氧+VEGF组相比低氧组，CD31及FLK-1表达明显增高，而ADSCs与bEND.3细胞共培养组相比其他组拥有最好的血管化效果，可以发现毛细血管样组织，说明了异型细胞间的作用在血管生成中的重要作用。其他一些研究还发现，经胰蛋白酶处理后的干细胞产生VEGF及IGF的能力较未处理组要高[25]；Barros等[23]发现，低氧加上乙酰半胱氨酸培养ADSC，对比仅低氧处理，VEGF表达明显降低；郝晓娟等[33]发现，缺氧预处理200 μmol/L氯化钴培养液对hUMSC分化为内皮样细胞有促进作用；相比二维支架，三维支架培养的干细胞有更高的可塑性以及更大的细胞间作用能力[9]，而三维支架材料包括人工合成高分子聚合材料、纳米材料等，不同的支架对在其上生长的细胞有不同的影响。另外，Darland等[34]发现，TGF-β能够促进小鼠胚胎间充质干细胞（Embryonic mesenchymal stem cells，EMSC）分化为VSMC，促进血管基底膜的形成，从而增加新生血管的稳定性，而EC周围的EMSC起到引导及模板的作用。而TGF-β分为多种亚型，具体哪种亚型起到关键作用以及TGF-β是否对成体干细胞具有同样作用还需进一步研究。

不同的体外培养条件对成体干细胞血管化有不同影响，低氧加上细胞因子，以及低氧条件下细胞共培养相比单纯低氧条件诱导成体干细胞，具有更好的促血管化效果。氧气浓度、相关细胞因子、共培养细胞及三维支架材料的选择及优化，成为促进成体干细胞血管化的研究方向。此外，TGF-β对稳定血管的特殊作用，可能作为将来促进血管化的选择条件之一，而胰蛋白酶预处理及其他相关培养条件，对于促进成体干细胞血管化的作用亦不容忽视。

6 小结

利用组织工程和再生医学进行损伤组织的修复，是目前较为理想的治疗模式，而体外干细胞的血管化具有极其重要的作用，如何快速血管化及增加新生血管的稳定性，是当前研究的重点和难点。成体干细胞作为一类多能干细胞，因其较胚胎干细胞更易获得、不涉及伦理问题、具有多向分化潜能而在近年来备受青睐，体外诱导BMSC血管化条件相对简单，单纯低氧甚至常氧条件下即可诱导其血管化，但其来源及体外扩增问题限制了其广泛应用。ADSC相对较易获得，但血管化能力弱于BMSC，单纯低氧不能诱导其血管化。较为常用的低氧诱导浓度为1%、3%及5%，但其最佳培养氧浓度仍存在争议。近年来，相关诱导成体干细胞血管化的研究虽取得一定成果，但至今还没有诱导BMSC及ADSC血管化条件的具体标准，包括低氧条件、培养时间、细胞因子、干细胞的类型、支架材料等。其他如hAMSC及hUMSC等，因具有优越的增殖分化能力有望成为以后的研究发展方向。已发现HIF-α及SDF-1等通路与低氧引起成体干细胞血管化有关，但具体机制仍需进一步探究。

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Angiogenesis of Adult Stem Cells Induced by Hypoxia

WANG Qiong,LU Mujun.

Department of Urology,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.
Corresponding author: LU Mujun(E-mail:lumujun@163.com).

【Summary】In recent years,tissue engineering and regenerative medicine provide a new method to treat the damaged tissues and organs,but under the pathological conditions,the low survival rate of the transplanted stem cells limits its function.Because of this,hypoxic preconditioning of the stem cells in vitro become a new solution to improve its ability to resist hypoxia and injury.In this paper,the advantages and disadvantages of different inducing conditions and different adult stem cells were reviewed to search the ideal conditions of angiogenesis.

Hypoxia;Adult stem cell;Angiogenesis

Q813.1

B

1673－0364（2015）04－0274－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.04.015

2015年3月29日；

2015年5月6日）

国家自然科学基金面上项目（No.81370860）。

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院泌尿外科。

卢慕峻（E-mail：lumujun@163.com）。