干细胞与脊髓损伤的治疗

韩倩倩 许 琰 王 宏 黄经春

干细胞与脊髓损伤的治疗

韩倩倩 许 琰 王 宏 黄经春

脊髓损伤的治疗一直是世界性的难题，促进脊髓损伤后神经组织的修复，传统的手术和相应的辅助治疗并未取得突破性进展。组织工程学的发展，为神经组织的修复提供了良好的可能。被移植到患者脊髓损伤区域的干细胞，通过替换受损细胞、减少胶质瘢痕的形成、促进残存神经元细胞轴突再生及突触形成等，可促进脊髓形态及功能恢复。我们就目前应用干细胞治疗脊髓损伤的研究现状进行概述，并对其临床应用前景进行展望。

脊髓损伤干细胞组织工程

脊髓损伤（Spinal cord injury，SCI）的治疗一直是世界性的难题，不仅给患者及其家庭带来重创，也给社会增加了沉重的负担。近年来，交通与工伤事故分居脊髓损伤发病率的前二位[1]。促进脊髓损伤后神经组织的修复，传统的手术和相应的辅助治疗并未取得突破性进展。组织工程学的发展，为神经组织的修复提供了可能。组织工程支架联合干细胞或单独使用干细胞的治疗方式在动物实验中取得了很好的效果。被移植到患者脊髓损伤的区域的干细胞，通过替换受损细胞、减少胶质瘢痕的形成、促进残存神经元细胞轴突再生及突触形成等，可促进脊髓形态及功能恢复。

脊髓损伤分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤即为初始的机械性损伤；继发性损伤由特殊的细胞和分子机制构成，包括谷氨酸兴奋性毒性、自由基生成、脂质过氧化、炎症和缺血（最终导致损伤周围的神经细胞凋亡、脊髓坏死）等，最终导致脊髓损伤部位不同程度的脱髓鞘和脊髓空化。

以往的治疗主要包括局部冷冻、手术减压、手术吻合、神经移植等前期外科治疗，药物治疗，物理康复，以及应用酶制剂来抑制和消除结缔组织瘢痕等后期治疗。手术减压可恢复受损区域的稳定性，药物治疗在抑制或减轻其继发性损伤中具有一定作用，物理、心理、康复、营养等综合治疗亦可对功能些许促进作用。但是，在促进患者功能恢复上并未取得显著的突破性进展。

众所周知，神经系统损伤到伤后功能恢复的关键是细胞的存活、轴突的再生、再生轴突生长方向的准确定位和修复精确而有功能的突触联系。自Reynolds等[2]从鼠的神经组织中提取出了具有分化潜能的神经干细胞开始，脊髓损伤的治疗走向了细胞治疗的方向，给脊髓损伤的治疗带来了希望。干细胞移植治疗脊髓损伤的方式大体有3种，即局部种植、经静脉注射途径和腰穿途径。脊髓损伤急性期治疗中，由于伤后1~2周内，损伤区域的微环境最适合干细胞的生长及分化，故此时为最佳移植时间段。我们就目前应用干细胞治疗脊髓损伤的研究现状进行概述，并对其临床应用前景进行展望。

1干细胞的种类及其相应特点

干细胞治疗脊髓损伤的主要优势包括①代替受损的神经细胞；②保护损伤脊髓中的内源性细胞，缓解残存神经细胞的凋亡；③促进残存神经元细胞轴突再生与突触形成；④促进残存和再生轴突的髓鞘形成；⑤减少胶质瘢痕的形成，提高移植干细胞的可塑性，并为内源性修复机制创造适宜的微环境。

目前可供选择的干细胞包括iPS细胞（自体细胞）、胚胎干细胞（ESCs）、神经前体细胞（NPCs）、少突胶质前体细胞（OPCs）、Schwann细胞（SC）、嗅鞘细胞（OECs）、骨髓间充质干细胞（MSCs）、神经干细胞（NSCs）、多潜能干细胞（iPSCs）、脐血干细胞，以及皮肤、脂肪组织来源的干细胞等。

研究表明，脂肪、皮肤、黏膜组织来源的干细胞在体内外特定条件下可转化成神经细胞，因其具有可自体移植、损伤性小、易于取材并且组织自我更新快等优点，使其成为自体移植修复脊髓损伤的理想细胞来源[3-6]。

另外，目前尚没有确切的研究表明干细胞治疗脊髓损伤的3种移植方式的疗效差异和优劣。

1.1 胚胎干细胞

胚胎干细胞是从胚胎或新生幼体中分离出的干细胞，具有多向分化潜能，但一般只向特定的细胞系分化，最早用于治疗脊髓损伤的研究。胚胎干细胞治疗脊髓损伤主要通过诱导神经元和胶质细胞来替代受损神经细胞，修复脱髓鞘化轴突。另外，植入的胚胎干细胞还能改善损伤区域的微环境，提高神经细胞存活率。但是，有研究表明，胚胎干细胞的移植有致瘤性，并且临床应用也面临着医学伦理及免疫排斥等关键阻碍[7]。

Yoo等[8]将可控表达细胞黏着分子L1的人胚胎干细胞植入脊髓损伤的小鼠中，结果显示实验组小鼠后肢运动功能评分（BMS）高于对照组。Baharvand等[9]利用视磺酸和碱性成纤维细胞生长因子作为诱导剂，将胚胎干细胞于三维胶原支架进行附壁培养、分化。超微结构分析可观察到分化后的细胞具有典型的突触结构。Yang等[10]在大鼠脊髓损伤模型中，将猪的胚胎干细胞和神经主细胞移植到损伤部位。结果显示，在运动学功能评分（BBB）中实验组得分明显高于对照组，且观察到后肢有明显的功能恢复。

1.2 骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞是多功能分化干细胞，因其细胞具有分化为间叶组织细胞的能力而得名，是骨髓中的造血结构和功能性支持细胞。因为具有独特的低免疫原性和免疫调节能力、易于扩增与保存、异体移植排斥反应小、捐献简单容易接受、可用于自体移植以及多器官归巢效应等优势，在脊髓损伤治疗的相关研究中得到广泛关注。虽然有相关报道显示骨髓间充质干细胞可分化为神经细胞，但其在移植后能否形成功能性神经元还缺乏有力证据。

Nakajima等[11]将间充质干细胞移植入脊髓损伤模型后，能显著上调L-13、L-4的表达，而TNF-α、IL-6表达明显下降，从而改变了巨噬细胞表型，减少了瘢痕组织形成与轴突、髓磷脂的损失，提高了动物运动功能的恢复。Woodbury等[12]发现，骨髓间充质干细胞可在某些化学物质诱导下分化为神经元细胞。除了直接代替损伤的少突胶质细胞和神经细胞外，骨髓间充质干细胞还可通过释放生长因子和细胞因子、促进血管生成、提供合适的生长基质、免疫调节和控制空洞形成等作用，对限制损伤扩大和促进再分化具有重要意义[13]。Penha等[14]运用狗的自体骨髓间充质干细胞治疗自体脊髓损伤。移植10 d后，腱反射逐渐恢复，并出现微弱的浅、深痛觉反应。研究提示，骨髓间充质干细胞可能在脊髓损伤干细胞治疗方面具有潜在的应用价值。

1.3 神经干细胞

神经干细胞属于单能干细胞，存在于中枢神经系统中，能自我更新、复制，并向神经元、星形胶质和少突胶质细胞分化。动物实验发现，体内移植的神经干细胞大多分化为星形胶质细胞，而并非神经元与少突胶质细胞，并且这种分化会引起剧烈疼痛[15]。因此，神经干细胞体内分化调控的技术是需要突破的重点。

Emgard等[16]将神经干细胞植入到脊髓损伤的大鼠中，发现宿主神经元与存活的细胞连接良好；BBB评分及网格步行与足印分析提示，大鼠后肢运动功能有明显恢复。Medalha等[17]将神经干细胞移植到大鼠脊髓全断模型中，观察到神经干细胞可分化为神经元，或者接替受损的脊髓神经。但是，在较严重的脊髓损伤或完全脊髓损伤的治疗中效果欠佳，胚胎脊髓的移植效果要明显优于神经干细胞。研究表明，神经干细胞移植在较严重的脊髓损伤治疗中的关键是细胞存活率和功能连接的形成方面。Gao等[18]将神经干细胞移植入胆碱能运动神经元缺陷的大鼠模型后，观察到由神经干细胞分化的胆碱能神经元的轴突，能穿越腹侧神经根和坐骨神经，并与外周肌肉组织形成神经-肌肉接头，该动物的运动功能得到显著改善。

1.4 诱导多潜能干细胞

Yamanaka等[19]将Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc等4个基因通过逆转录病毒介导，转入鼠成纤维母细胞，之后通过对转染后细胞Fbx15的表达进行筛选，首次获得具有干细胞功能的细胞，即诱导多功能干细胞。Okita等[20]随后根据对Nanog的表达进行筛选，得到iPS细胞，其功能接近于胚胎干细胞，解决了医学伦理学上的障碍，但是所植入的基因表达能力会减弱，且在宿主体内存活时间不长，病毒载体所导致的免疫排斥反应及可能的致瘤性还有待商榷[21-22]。之后，有研究将iPS细胞进行体外诱导分化，可得到理想的干细胞类型，从而避免了上述问题[23-26]。

Kimura等[25]将胚胎干细胞体外诱导成神经干细胞后，移植到小鼠损伤的神经细胞周围，发现小鼠损伤神经纤维发生髓鞘化。Fujimoto等[27]的实验观察显示，在免疫缺陷小鼠的脊髓损伤模型中，经iPS细胞治疗后，小鼠运动功能有一定恢复。

1.5 脐血间充质干细胞

脐血间充质干细胞可分化为神经元及神经胶质细胞，且获取容易，对供者无损害；可在体外进行增殖培养，在低温冻存下可以长期存活并建立脐血干细胞库；可在脊髓损伤中抗细胞凋亡、分泌多种神经营养因子，具有神经保护作用[28]。虽然脐血干细胞的应用不存在伦理学争议，但在临床应用上还是存在一些问题的。

Hu等[29]用超顺磁纳米颗粒（Superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIO）标记的MRI显示，人脐血干细胞能迁徙并能存活在大鼠脊髓损伤区域，进而促进大鼠神经功能的恢复。Park等[30]将脐血间充质干细胞移植到大鼠脊髓挫伤区域，术后1周内，每天给大鼠注射一次BrdU。大鼠的行为学分析表明，大鼠运动功能得到了明显的恢复，且脊髓空洞体积更小，降低了细胞的凋亡。在实验组，原位末端标记的细胞减少了，而BrdU标记的细胞明显增多。研究显示，在大鼠体内植入脐血多功能干细胞后，可缩小星形胶质细胞活化范围，提高残存轴突的存活，减少caspase-3与ED-1阳性细胞的数量[31]。

1.6 Schwann细胞

Schwann细胞分为有髓鞘和无髓鞘两种，是构成周围神经细胞的主要细胞，可传导神经冲动，营养神经元，参与神经的生长和再生，分泌神经细胞外介质，介导抗原以及调节运动神经活性[32]。

夏雷等[33]把神经干细胞与Schwann细胞种植在共聚物支架上，移植到脊髓损伤的大鼠中，Schwann细胞可促进轴突再生及髓鞘化、促使神经干细胞向神经元样细胞方向分化，且部分神经元样细胞还可能形成了突触连接。崔学文等[34]将外胚间充质源的Schwann细胞种植在纤维蛋白胶支架上，移植到脊髓损伤的大鼠中。细胞加支架组较对照组大鼠后肢运动能力有明显恢复，单纯支架组也有一定程度的恢复，但程度较低。另外，免疫组化染色显示，细胞加支架组可见大量神经网络状结构。说明Schwann细胞对脊髓损伤后的组织学与功能恢复有明显促进作用。Kanno等[35]在脊髓损伤的大鼠模型中植入基因修饰的可分泌神经营养蛋白和软骨素酶的Schwann细胞，发现可促进大鼠神经轴突的再生并提高运动、感觉功能的恢复。

2 对于干细胞的特殊处理

除了iPS细胞外，在干细胞用于脊髓损伤治疗之前，也可对其进行各种处理，以促进细胞治疗的效果。

2.1 诱导细胞向神经元样细胞分化

iPS细胞与胚胎干细胞存在着一定的致瘤风险，而骨髓间充质干细胞往神经元样细胞分化的概率很小，如果在体外诱导上述细胞向神经元样细胞分化，既消除了致瘤的可能性，又提高了细胞的修复功能。

高平等[36]采用了生物及化学两种诱导方式，诱导骨髓间充质细胞分化为神经元样细胞。实验分4组，每组12只大鼠，采用脊髓半横断模型。建模后12周，生物诱导组大鼠运动功能持续恢复，显著优于其他3组。脊髓组织切片HE染色显示，化学诱导组与骨髓间充质干细胞组近似，神经元样细胞崩解、胶质细胞增上、空洞形成少于DMEM培养液组，生物诱导组最佳。喻永涛等[37]将30只大鼠随机分为实验组与对照组，每组15只。体外培养脐血间充质干细胞并向神经元样细胞方向诱导分化，用Hoechst标记后用于实验组，而对照组注射PBS液。结果显示，在脊髓病理切片中出现上述标记的移植细胞，5周后移植组功能恢复优于对照组。可见，诱导分化后的神经元样细胞可以促进鼠脊髓损伤的功能修复。

2.2 干细胞联合细胞因子促进脊髓损伤修复

张占修等[38]在脊髓损伤的大鼠的尾静脉注射脐带间充质干细胞，乌司他丁组腹腔注射。4周后观察发现，大鼠下肢运动功能恢复优于单纯的细胞移植组和单纯的乌司他丁注射组；并且，PKH26标记的阳性细胞数量明显多于其他组。实验提示，联合应用脐带间充质干细胞和乌司他丁，可促进脊髓损伤大鼠神经突粗的再生，改善肢体电生理功能和运动功能。赵志军等[39]研究自由基清除剂依达拉奉联合神经干细胞移植对大鼠行为学的影响。实验在8周后观察到，PKH-26标记的神经干细胞在体内存活且在脊髓内迁移，可见少量连续性神经纤维通过损伤区，且荧光金逆行脊髓追踪显示，神经椎体细胞穿越了损伤区，且后肢运动功能BBB评分最高。实验说明，依达拉奉能促进干细胞在损伤区的存活并向神经细胞分化，且联合移植脐带间充质干细胞可显著提高大鼠脊髓损伤的修复效果。

2.3 两种细胞共移植

不同干细胞种类各具优势，比如神经干细胞能有效分化为神经元样细胞，而骨髓间充质干细胞能有效缓解炎症环境。如果将两种细胞共同移植到脊髓损伤区域，将可能产生协同作用，并更加有效地修复脊髓损伤。

Luo等[40]研究神经干细胞与嗅鞘细胞的共移植，在感觉功能提高上的效果及潜在的分子机制。在热痛阈和机械痛阈的测量中，神经干细胞恢复了脊髓损伤大鼠的感觉功能，而嗅鞘细胞则可引起痛觉过敏。共移植可促进神经干细胞的存活，逆转嗅鞘细胞引起的痛觉过敏，这对神经感觉功能的恢复起到很大作用。同时，实验还发现，在共移植组的大鼠中，神经生长因子的表达大幅下调。推测这两种细胞的共移植在脊髓损伤修复中的可能机制为下调神经生长因子的表达。叶超群等[41]实验探讨嗅鞘细胞与Schwann细胞的共移植对大鼠脊髓损伤修复的影响。结果显示，5~8周后，实验组BBB评分较对照组高，9、10周时两组无明显差异。造模后10周，实验组大鼠脊髓损伤部分瘢痕及损伤范围较小。说明两种细胞的共移植在一定程度上促进了大鼠损伤脊髓的恢复，但未能促进大鼠后肢运动功能的提高。

2.4 干细胞基因转染后移植

某些生长因子或蛋白类的物质能缓和炎症环境，提高移植细胞的生存率，增加干细胞定向分化的机率，从而提高脊髓损伤的修复效率高。因此，将目的基因转染到移植的干细胞内，使其持续产生相应蛋白，这就使损伤脊髓的修复达到更好的效果。

研究表明，通过慢病毒介导的神经营养因子-3稳定转染大鼠骨髓间充质干细胞，转染率可达到60%~70%，并且目的基因和神经营养因子-3蛋白的表达可以被检测到，从而为干细胞治疗脊髓损伤提供了一种新的方式[42]。Kumagai等[43]于大鼠脊髓损伤7 d后，在损伤中心分别植入PBS（对照组）、GFP标记的骨髓间充质干细胞、用GFP标记修饰后表达MNTS1的骨髓间充质干细胞，以及用GFP修饰后表达MNTS1/P75-的细胞。实验观察显示，与对照组相比，所有的移植组炎症反应都有缓解，并且囊性空腔都相对缩小。而且，基因修饰的两实验组轴突生长明显提高、皮肤过敏反应显著改善。另外，MNTS1/P75-组中移植物促进了血管生成，且改善了胶原瘢痕。

3 干细胞治疗脊髓损伤的研究及临床应用现状

3.1 干细胞治疗在动物实验中的效果

干细胞被用于多种动物的脊髓损伤修复实验中，从目前的实验结果来看，动物后肢的运动功能及感觉能得到一定程度的恢复，疗效满意。Li等[44]使用复合表皮生长因子受体抗体的功能化胶原支架，促进神经前体细胞的神经分化，来修复大鼠脊髓损伤。在体外实验中观察到，对于暴露于髓磷脂蛋白质的神经前体细胞，采用1 μg西妥昔单抗附合的胶原支架，能促进向神经元方向的分化，并抑制向星形胶质细胞方向的分化。体内实验中，将表达绿色荧光蛋白的神经前体细胞嵌入的支架，移植到4 mm长的大鼠半切损伤区域，发现复合5 μg西妥昔单抗的胶原支架，诱导了神经前体细胞向神经元方向分化，减少了向星型胶质细胞方向的分化，促进了轴突的再生，明显提高了神经功能的恢复。Iwasaki等[45]将自组装肽与神经干细胞，通过直接注射的方式，植入大鼠颈部脊髓损伤模型，发现能协同促进组织与前臂功能的恢复。Himes等[46]将骨髓干细胞通过静脉注射的方式，植入脊髓损伤的小鼠体内，小鼠BBB评分2周后明显提高，行走功能及温度觉显著恢复。

3.2 干细胞的临床研究现状

干细胞治疗脊髓损伤具有独特的优点，但临床使用还存在着未知风险和尚未解决的技术问题。因此，干细胞的临床治疗还需要进一步深入探索。Dai等[47]将患者自身的骨髓间充质干细胞移植到完全性、慢性的颈段脊髓损伤部位，40例患者中，实验组患者的功能相比对照组明显恢复，且在观察的6个月中无肿瘤发生迹象。李志营等[48]对78例脊髓损伤患者行自体脊髓间充质干细胞与自体腓肠神经联合移植的方法进行治疗研究，结果显示具有一定的疗效，证实了自体脊髓间充质干细胞与周围神经共移植治疗脊髓损伤的方法安全有效。Yazdani等[49]用自体Schwann细胞与骨髓间充质干细胞联合移植，治疗慢性脊髓损伤，并对安全性与可行性结果进行评价。共8名完全性创伤性脊髓损伤患者参与了该研究，平均随访2年。MRI显示，所有患者并没有瘤性组织增生、脊髓空洞症等迹象，同样也没有出现感觉和运动功能的退化。3名患者ASIA感觉量表评分有轻微提高，但ASIA等级没有改变，同时运动分数没有提高。患者普遍主观感觉有所改善，比如排尿与排便的感觉提高、坐姿更加稳定以及躯体的平衡能力得到改善。虽然两种细胞的联合移植治疗无明显效果，但其安全性得到了证实。Liu等[50]将脐血间充质干细胞通过鞘内注射的方式注入22名患者体内，每周1次，4次为1个疗程。其中，4例患者接受了2个疗程治疗，1例患者接受了3个疗程的治疗，其他患者为1个疗程。结果显示，通过注射方式进行脐血干细胞植入的方法是安全的，能够提高大部分非完全性脊髓损伤患者的神经功能和生活质量。

4 总结

干细胞治疗不论在动物实验，还是临床试验方面，都显示了在脊髓损伤修复治疗上的优势及前景。但脊髓损伤修复是多学科参与的工程，单靠干细胞移植不能解决所有与脊髓损伤治疗有关的问题，所以与早期手术治疗、新的药物治疗、康复手段、物理辅助、营养调理、相关分子或受体阻断物结合的治疗策略显得尤为重要，是将来研究的方向。

虽然干细胞在治疗脊髓损伤的研究中，有许多问题尚未解决，部分细胞移植存在伦理学争议和致瘤性风险，但是目前的研究成果已经揭示了其临床应用前景是广阔的。

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Stem Cells and the Repair of Spinal Cord Injury

HAN Qianqian1,XU Yan2,WANG Hong2,HUANG Jingchun3.

1 Department of Biomaterials and Tissue Engineering,Institute of Medical Device Verification,the National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050,China;
2 Department of Orthopedics,First Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116044,China;
3 SFDA-Jinan Quality Supervision and Inspection Center for Medical Devices,Jinan 250100,China. Corresponding author:WANG Hong(E-mail:768852847@qq.com);HUANG Jingchun(E-mail:sdzxhuangjc@163.com).

【Summary】Spinal cord injury is still a disease which is hard to cure in clinic and a project under research.The operation treatment and corresponding auxiliary treatment did not achieve a satisfied result.The cell-therapy of stem cells transplants to the patients'spinal cord injury area is a promising method.By the replacement of damaged cells,reducing the formation of glial scar,promoting the survival of neurons axonal regeneration and the synapse's formation,stem cell promote the recovery of function and morphology.In thispaper,the application of stem cell therapy in treating spinal cord injury was reviewed and prospected.

Spinal cord injury;Stem cell;Tissue engineering

R683.2

B

1673－0364（2015）04－0269－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.04.014

2015年5月20日；

2015年6月17日）

中科院先导计划课题（XDA01030504，XDA01030503）；863课题（2012AA020507）；国家自然科学基金（81271719，81341060）。

100050北京市中国食品药品检定研究院医疗器械检定所生物材料和组织工程室（韩倩倩）；116044大连市大连医科大学第一附属医院骨科（许琰，王宏）；250101济南市山东省医疗器械产品质量检验中心（黄经春）。

王宏（E-mail：768852847@qq.com）；黄经春（E-mail：sdzxhuangjc@163.com）。

注：韩倩倩，许琰为共同第一作者。