脑出血后血脑屏障损害研究进展

许楠，曹非

脑水肿是脑出血的严重并发症之一，严重程度与临床预后密切相关。血肿周围组织水肿发生在脑出血的超急性期，脑出血后24 h内水肿体积显著增大，3 d内脑水肿进展急骤，4～5 d达峰[1]。快速发展的脑水肿可能会导致颅内压增高甚至脑疝。作为维持中枢神经系统内环境稳态的重要结构，血脑屏障（bloodbrain barrier，BBB）损害引起的血管源性脑水肿是脑出血后脑水肿的主要类型。本文对脑出血后BBB损害的分子机制做一综述。

1 BBB的结构与功能

BBB由脑的连续毛细血管内皮及其细胞间的紧密连接、完整的内皮下基膜、周细胞以及星形胶质细胞脚板围成的神经胶质膜构成，是介于血液和脑组织之间，对物质（多半是有害的）有选择性阻碍作用的动态界面。曾认为脑血管内皮细胞间的紧密连接是调节BBB通透性的唯一因素，但最近的数据表明，BBB是一个更为复杂的系统，星形胶质细胞和周细胞对于维持BBB的正常功能也同样重要，构成BBB的各个组分间是相互作用，相互调节的[2-3]，其中任一组分的损伤，都可能引起其他组分发生变化，从而使BBB的结构和功能受到影响。

2 参与脑出血后BBB损害的分子机制

血管源性水肿是脑出血后脑水肿的主要类型，其中主要是BBB破坏促进血管源性水肿产生，下文对参与BBB破坏的分子机制展开详细阐述，有助于进一步对其作用途径、分子机制展开更深入的研究，以期获得防治BBB损害的理想作用靶点。

2.1 凝血级联反应与凝血酶 脑出血发生后，通过内源性及外源性凝血途径产生大量的凝血酶。凝血酶除激活血小板，催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，促进血液凝固外，还可促使炎症细胞及小胶质细胞释放炎症因子并激活凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅵ、凝血因子Ⅷ、蛋白酶激活受体（protease activated receptor，PAR）等[4]。研究表明，凝血酶的释放是触发脑出血后BBB损害和脑水肿形成的关键因素[5]。但对于脑出血患者而言，凝血酶抑制剂的使用可能不利于血凝块形成从而增加血肿扩大和再出血风险，因此全面了解凝血酶所致脑水肿与凝血酶诱导的BBB损害之间的关系，有助于寻找预防血管源性水肿发生的理想靶点。Liu等[6]经过动物实验推测凝血酶引起脑水肿的途径为凝血酶→PARs→Src家族激酶活化→BBB破坏→BBB通透性增加。向成年大鼠侧脑室内注入凝血酶后观察到大鼠BBB的通透性和脑组织含水量都明显增加，而立即给予腹腔注射非特异性Src家族激酶抑制剂——PP2能阻断凝血酶的这种作用。但是若在之后的5 d每天向大鼠腹腔注射1次PP2，BBB损害和脑水肿的恢复延迟。因此认为在急性期Src激酶活化引起BBB损伤；而在恢复期，Src激酶活化又促使BBB修复[7-8]。Ma等[9]向小鼠脑内注射自体动脉血后，小鼠脑组织中血小板源性生长因子受体α（platelet-derived growth factor receptor alpha，PDGFR-α）和血小板源性生长因子受体激动剂（PDGFR agonist，PDGFAA）表达都显著升高，而小鼠在接受凝血酶抑制剂——水蛭素注射后，以上检测指标明显下降，且水蛭素对BBB的保护作用也能被外源性的PDGFR-AA所逆转。此外，该研究还发现将凝血酶注射到小鼠脑内还会引起PDGFR-α激活以及下游p38MAPK信号通路和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表达增强。而腹腔注射PDGFR抑制剂——伊马替尼能阻止上述变化发生并明显减轻BBB损害和脑水肿。可见凝血酶可能作为上游调控因子激活PDGFR-α，再通过p38MAPK介导MMP表达或活化，使BBB的基膜和紧密连接蛋白发生降解，从而导致脑水肿。Cui等[10]向SD大鼠尾状核注射自体血液或凝血酶后，发现受损脑组织周围蛋白酶Cα和蛋白酶Cδ表达明显增加，而向SD大鼠腹腔注射PKC抑制剂（H7）后蛋白酶Cα表达明显下降，且BBB的通透性降低，脑水肿减轻，研究认为凝血酶对BBB通透性的影响可能是通过PKCα/PKCδ信号介导的，这一信号传导途径可以作为脑出血后BBB损害的治疗靶点。综上所述，目前对于凝血酶如何参与BBB损害进而促进脑水肿发生的问题存在着各种不同解释，这些不同的作用途径和分子机制可能在脑水肿病理进程中同时发挥作用并且相互影响。然而，这些机制也有待进一步探讨、论证，以期从中找出最佳的治疗靶点。

2.2 炎症级联反应与基质金属蛋白酶 脑组织一旦与血肿接触便立即启动各种炎症级联反应，引起BBB破坏，导致脑水肿形成[11]。脑出血后的炎症过程涉及中性粒细胞和巨噬细胞浸润，小胶质细胞和星形胶质细胞激活以及由此产生的炎症介质，包括细胞因子、活性氧自由基和MMP。脑出血后的4 h内，血肿周围出现中性粒细胞浸润，肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和促炎性蛋白酶开始表达[12]。中性粒细胞渗出是内皮细胞间黏附分子（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和中性粒细胞上的整合素（即CD18/CD11）相互作用的结果，而研究表明血管ICAM-1的表达受凝血酶-Src家族激酶信号传导途径调节[13]，因此凝血酶可能也参与了脑出血后中性粒细胞浸润从而促进血肿周围炎症反应发生。一般认为中性粒细胞浸润是导致脑出血后BBB损伤的原因之一，但缺乏直接证据。为了揭示中性粒细胞浸润对血肿周围BBB通透性的影响，Moxon等[14]先将中性粒细胞抗体注入大鼠静脉以清除大鼠血液循环中的中性粒细胞，之后向大鼠纹状体注射胶原酶建立脑出血模型。经此处理后，大鼠血肿周围浸润的中性粒细胞减少超过60%；进一步观察发现MMP-9的表达也大大降低，血肿周围BBB破坏减轻。Rosell等[15]对5例脑梗死出血性转化死亡患者的脑组织标本采用激光捕获显微切割技术和明胶酶谱分析等方法观察发现，脑出血区有大量中性粒细胞渗出和由其产生活化的MMP-9，该区域的BBB遭到破坏。可见中性粒细胞是MMP-9的主要来源，且能引起脑出血后BBB损害。MMP是一组能降解细胞外基质的锌原子依赖性内肽酶，制作脑出血模型时，向动物脑组织注射的细菌胶原酶便是MMP的一种；MMP除了降解细胞外基质，还能降解BBB的紧密连接蛋白[16-17]。生理状态下，MMP只微量表达且无活性，但脑出血后，炎症反应中产生的TNF、白细胞介素（interleukin，IL）、蛋白酶和自由基经多个环节激活MMP。MMP的过度激活可引起BBB损伤并导致脑水肿发生[18]。脑出血后脑组织和血清中MMP-9的含量在急性期（1～3 d）显著升高达到峰值，此后有所下降，到第7天左右又出现一个峰值，随后逐渐恢复到生理水平。脑出血后脑水肿的进展与MMP-9含量变化具有一定的时间相关性，且MMP-9第二个峰值的出现可能与其介导脑出血后神经系统修复有关[19-20]。Lei等[21]通过动物研究发现，在脑出血恢复期（10～14 d），MMP-9可能通过上调神经生长因子（nerve growth factor，NGF）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达从而促进神经与血管生成。但该研究未涉及MMP-9对BBB和脑水肿的影响。因此，MMP是否在脑出血后期有利于BBB重构以及MMP参与脑出血后脑水肿进程的详细机制仍需进一步研究，为应用其抑制剂进行临床治疗奠定基础。

2.3 补体级联反应与血红蛋白毒性 脑出血后补体系统激活的确切机制尚不完全清楚，目前认为是由于血肿部位凝血酶沉积所致[22]。补体级联反应的激活导致C3和C5裂解生成C3a和C5a，经C3a和C5a受体拮抗剂处理过的小鼠与未处理小鼠相比，脑出血后脑含水量显著降低[23-24]，可能与过敏毒素C3a和C5a增加血管通透性，促进炎症反应并作为强有力的趋化因子诱导白细胞迁移有关。然而，更重要的是补体系统激活后能通过形成膜攻击复合物（membrane attack complex，MAC）介导红细胞溶解，从而导致迟发性脑水肿。大鼠脑出血后24 h，血肿周围区域检测到C9聚集。72 h后检测到C9在细胞膜上沉积即MAC的形成[25]。另有研究显示，向动物脑内注射红细胞后2 d内并未产生明显的脑水肿，到第3天时检测到脑含水量明显增加[26]。这正好与脑出血后形成MAC介导红细胞溶解的时间相一致，推测溶解红细胞所释放的血红蛋白及其降解产物如血红素、铁离子等均可通过相应途径参与BBB破坏和脑水肿形成。Lin等[27]的动物实验发现血红素可通过toll样受体（toll-like receptor 4，TLR4）途径增强小胶质细胞活化，接着通过MyD88或TRIF信号通路激活核转录因子（nuclear factor-κB，NF-κB）并最终增加脑出血过程中细胞因子的表达和加重炎症损伤；也有研究认为血红蛋白通过诱发氧化应激进一步激活MMP-9造成早期的BBB损害和之后的细胞凋亡[28]。Yang等[29-30]则发现血红蛋白可诱导一氧化氮合酶过度表达进而生成过量的一氧化氮及其代谢产物——过氧亚硝基阴离子。这些产物可能通过进一步激活MMP-2和MMP-9等间接造成BBB损伤。而炎症反应中释放的细胞因子如TNF也可诱导一氧化氮合酶过度表达[31]，一氧化氮合酶过度表达可能是炎症级联反应造成BBB破坏的途径之一。根据上述研究结果不难发现，血红蛋白及其降解产物导致BBB破坏的作用与其触发炎症反应进而激活MMPs在很大程度上存在关联。血红蛋白的另一降解产物——铁离子也可通过炎症反应中产生的自由基和MMPs引起BBB损伤和脑水肿[32]。Qing等[33]在实验中向SD大鼠右侧尾状核立体定向注射自体血液后观察到铁在血肿周围沉积，水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP-4）在血肿周围的表达上调，血肿周围脑组织含水量也相应增加。当以去铁胺腹腔注射减少脑出血大鼠血肿周围铁负荷后，与未经去铁胺处理的对照组脑出血大鼠相比，其血肿周围AQP4的表达水平和脑组织含水量都明显下降，提示铁离子与AQP-4相互作用可能是脑出血后脑水肿形成的关键因素之一，但有待进一步证实。

2.4 水通道蛋白4 AQP-4在围绕脑微血管的星形胶质细胞终足上表达，是介导水进出脑组织的主要蛋白质。AQP-4的表达增高或降低会影响脑水肿的发生和发展，但其确切的调节机制仍存争议。Sun等[34]经尾状核自体血液注射制备大鼠脑出血模型，实验组大鼠所注射的自体血液中混有重组水蛭素以抑制凝血酶活性。结果发现，实验组脑出血大鼠AQP-4的表达下调，脑水肿也明显减轻。Manaenko等[35]通过胶原酶诱导小鼠脑出血后，以精氨酸加压素V1a受体拮抗剂处理的小鼠与安慰剂组小鼠相比，发现血肿周围AQP-4表达降低且脑水肿程度和BBB损害都减轻，因此认为精氨酸加压素在脑出血后可能通过AQP-4介导脑水肿产生和发展。但有研究得出相反的结论即AQP-4的表达水平与脑水肿程度呈负相关。Tang等[36]将自体全血分别注射到AQP-4+/+和AQP-4-/-小鼠的纹状体，比较注射后两组小鼠BBB破坏程度、脑水肿体积和神经元坏死情况。结果发现将AQP-4基因敲除的小鼠BBB破坏程度、脑水肿体积和神经元坏死情况均较正常小鼠严重，该研究认为脑出血后AQP-4增高有减轻脑水肿的作用。Chu等[37]在小鼠相关研究中发现血管内皮生长因子对血肿周围脑水肿有保护作用，且能减轻神经功能缺损和神经元死亡，但不影响脑出血后BBB通透性。上述保护作用可能与VEGF经c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信号通路介导AQP-4表达上调有关。Chu等[38-39]亦认为粒细胞集落刺激因子和促红细胞生成素同样可作为AQP-4的上游调控分子减轻脑出血后BBB损害和血肿周围脑水肿。上述实验结果的差异可能是由于AQP-4对脑水肿有双向调节作用造成的[40]。在细胞毒性脑水肿形成中AQP-4有加重脑水肿的作用；而在血管源性脑水肿的发展过程中则具有减轻脑水肿的作用。脑出血后细胞毒性脑水肿和血管源性脑水肿并存，它们对水肿体积的作用大小可能影响着实验中AQP-4与脑水肿的相关性。近期一项研究发现，AQP-4可能也参与了病理状态下Ca2+信号转导，从而使脑水肿加重。Thrane等[41]的动物实验表明，脑细胞肿胀会引起ATP等细胞毒性物质释放，然后导致更严重的脑组织损伤与水肿；而在这个恶性循环中的Ca2+信号转导受到AQP-4调控。鉴于AQP-4与BBB和脑水肿有着千丝万缕的联系，研究AQP-4的拮抗剂和激动剂对于治疗脑出血后脑水肿有着十分重要的意义。

脑出血后导致BBB损害的因素是多方面的，机制涉及多个因子间的相互作用。在不同时期，某些因子的作用也不相同，甚至截然相反。而且虽然某些因子已被确认是介导BBB损害发生的效应因子，但是它们能否成为合适的治疗靶点尚未可知。

未来的研究应该着眼于两个方面：在宏观上，观察脑出血后BBB损害和恢复的时相变化与脑水肿发生、发展的关系从而进一步明确脑出血后不同时期BBB损害对脑水肿的影响；在微观上，继续寻找和确认脑出血后在BBB损害和脑水肿过程中发挥“瓶颈”作用的分子（可能不止一种），并在不打破机体正常平衡状态的前提下加以抑制，以期在临床上获得更好的治疗效果。

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【点睛】

本文对近年来关于脑出血后血脑屏障损害机制的研究热点及其新进展做了详细阐述。