两株高效耐盐菌的分离鉴定及生长特性研究

单德鑫　李海统　黄河　等

摘要：从大庆不同利用类型的盐碱土地区取土样，经驯化、分离筛选出两株高效耐盐菌，分别命名为A和B。经形态特征观察、生理生化试验、扫描电镜观察和16S rDNA鉴定得知，菌种 A 为脱氮嗜盐芽孢杆菌（Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037），菌种 B为咸鱼芽孢杆菌（Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1），均为芽孢杆菌属。经过单因素试验，得出A、B的最适生长条件均为温度30 ℃，pH 7～9，盐浓度20%，这将为以后该地区微生物资源开发利用提供理论依据。

关键词：盐碱土；高效耐盐菌；分离；分子鉴定；生长特性

中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）22-5395-03

松嫩平原盐渍土分布十分广泛，是我国盐渍化土壤的最大分布区，其地处半湿润半干旱区，具有广泛的闭流区和矿化度很高的无尾河，年降水量约450 mm[1]，该区盐渍土主要分布在平原西部的半干旱和干旱地区，主要包括吉林西部的松原和白城地区，黑龙江的三肇、安达、大庆和齐齐哈尔等地区[2]。其中大庆的盐碱化土地面积为13.69×104 hm2，占其土地总面积的28.3%[3]。土壤盐渍化导致大量土壤资源丧失，农业生产条件恶化，严重阻碍了当地农业和农村经济的持续健康发展。因此本试验从大庆盐碱地区取样，分离筛选耐盐菌种，对当地盐碱土中微生物资源状况进行初步探索，为以后该地区微生物资源开发利用提供理论依据，为研发更加成熟的菌剂提供基础和依据。

1 材料和方法

1.1 材料

分别从大庆的盐碱地区的农田、农田秸秆还田结合区、农田休耕结合区、湖边、碱泡地、石油区取得土样，具体地点如表1所示。

培养基的组成如下。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 调至7.2～7.4。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH调至7.2～7.4。LB培养基：酵母膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH调至7.2～7.4。所有培养基在121 ℃，0.1 Mpa下灭菌20 min备用[4]。

1.2 菌种的分离纯化及筛选

将土壤样本分为6组，每组各取0.1 g置于100 mL三角瓶中，加入50 mL蒸馏水，加玻璃珠充分打散，于120 r/min摇床中培养3 d[5]。各取1 mL悬液稀释浓度至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别涂布到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养3 d，用划线法纯化培养，然后把已经纯化得到的菌种接种到NaCl浓度分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%和32% 的牛肉膏蛋白胨的液体培养基里[6-8]，置30 ℃下培养，观察生长情况，以确定细菌耐盐程度[9]。

参考《常见细菌系统鉴定手册》，通过对菌种进行形态学观察及相关生理生化试验，从而对菌种A、B进行初步鉴定[10]，扫描电镜观察进一步鉴定。而后进行耐盐菌的分子鉴定，即提取菌种的DNA，然后采用细菌16S rDNA的通用引物进行PCR扩增。BSF8/27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；BSR

1510/1492：5′-GGTTACCTTCTTACGACTT-3′。

PCR反应体系（50 μL）：5 μL 10 × Buffer，4 μL 2.5 mmol/L dNTP，2 μL BSF8/27 引物（0.1 nmol/μL），2 μL BSR1510/1492引物（0.1 nmol/μL），0.5 μL Taq酶（5 U/μL），1 μL模板DNA，35.5 μL双蒸水。反应条件如下：

94 ℃ 预变性 5 min

94 ℃ 变性 45 s

55 ℃ 退火 90 s

72 ℃ 延伸 2 min

72 ℃ 延伸 10 min

PCR反应产物的纯化以及测序由上海生工完成。16S rDNA同源性比较与系统发育学分析将所测得的序列于Genbank上进行Blast比对，利用MEGA 4.0软件构建系统发育树[11]。

1.3 菌种的生长特性研究

为研究菌种的最适生长条件，进行单因素试验。

1.3.1 温度 向液体牛肉膏蛋白胨培养基中接入2 mL菌悬液，分别在15、20、25、30、35、40 ℃条件下培养，均做3个平行试验，120 r/min振荡24 h后，测定培养基内菌液OD值。

1.3.2 pH 将菌悬液分别接入pH为3、5、7、9、12的牛肉膏蛋白胨液体培养基内，其他条件同上，测定24 h后培养基内菌液OD值。

1.3.3 盐浓度 将菌悬液分别接入盐浓度为10%、15%、20%、25%、30%的牛肉膏蛋白胨液体培养基内，其他条件同上，测定24 h后培养基内菌液OD值。

2 结果与分析

2.1 菌种的分离纯化及筛选

将取样地样本进行初筛，共获得34株菌。再经富集培养、梯度稀释的菌液涂布于筛选培养基培养，将其纯化后转接到筛选培养基上，30 ℃培养2～5 d。在平板培养基上选取高浓度区域以外分散的单菌落，根据菌落大小、形状、颜色、隆起程度、表面光泽、透明程度、边缘形状和在高盐浓度下生长情况等差别，最终分离出2株菌落，分别命名为菌种A、B。

2.2 菌种鉴定

2.2.1 菌种形态特征观察 菌种A呈米黄色，菌体表面光滑并且湿润，单一菌落形状为长圆形，边缘平滑，在液体培养基生长浑浊，容易被挑起，没有菌膜形成，无沉淀。菌种B呈乳脂状，呈现乳白色，透明，单一菌落形状为圆形，边缘为锯齿状，菌体表面光滑且湿润，不容易被挑起；在液体培养基生长浑浊，没有菌膜形成，无沉淀。

2.2.2 菌种生理生化鉴定 菌种A、B均能进行葡萄糖氧化产酸，在生长温度测定试验中均有浑浊，无沉淀物和悬浮物产生。生长物有穿刺线向四周呈云雾状扩散，表示菌种均有运动性。其他结果见表2。

2.2.3 扫描电镜观察 菌种A和菌种B都是杆状菌，菌种A和B的扫描电镜的照片见图1，照片的放大倍数是10 000倍。菌体大小分别为（1.0～1.5） μm×（0.5～1.0） μm和（0.5～2.0） μm×（0.5～1.5） μm，均无芽孢，无鞭毛。

2.2.4 菌种的分子鉴定 菌种A及菌种B的完整基因序列长度分别是1 452 bp和1 451 bp。将菌种A的16S rDNA基因序列与GenBank数据库中的数据比对发现该耐盐菌的基因序列与Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037同源性达到了99%。根据比对结果建立系统发育树，见图2。由分子鉴定结果可知，高效耐盐菌A属芽孢杆菌属。

将菌种B的16S rDNA基因序列与GenBank数据库中的数据比对，该菌基因序列与Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1同源性达99%。根据比对结果建立系统发育树，见图3。由分子鉴定结果可知，高效耐盐菌B属芽孢杆菌属。

2.3 菌种的生长特性研究

2.3.1 温度对菌种生长的影响 由图4可知，菌种A和B的最适生长温度均为30 ℃，温度升高至35 ℃时，菌液的浓度降低，菌种生长十分缓慢。

2.3.2 pH对菌种生长的影响 由图5可知，菌种A在pH为7～9时生长状态良好，pH为3～5时生长十分缓慢。菌种B在pH为7～9时生长情况较好，pH为12时仍能生长。综上所述，菌种A、B的最适pH值范围为7～9，强酸的条件不适合菌种的生长，强碱性的条件菌种能够生长。

2.3.3 盐浓度对菌种生长的影响 由图6可知，盐浓度为10%～15%时，菌种A和B生长缓慢，盐浓度为15%～25%时，菌种A和B生长迅速，盐浓度为25%～32%时，菌种A和B仍能生长，但生长缓慢，综上所述，菌种A和B耐盐范围比较大，可耐受较高盐浓度。

3 小结与讨论

1）以大庆盐碱地取得的土壤样本为菌源，利用采用牛肉膏蛋白胨培养基，稀释平板法分离纯化，最终筛选得到能够最高耐受盐浓度32%的菌种A和菌种B。

2）经一系列生理生化试验鉴定和16S rDNA测序比对，菌种A 为脱氮嗜盐芽孢杆菌（Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037），菌种 B 为咸鱼芽孢杆菌（Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1），菌种A和B均属芽孢杆菌属。

3）通过单因素试验可知，菌种A、B最优条件组合均为：温度30 ℃，pH在7～9，盐浓度20%。在此条件下，菌种生长最好。

参考文献：

[1] 刘兴土.松嫩平原退化土地整治与农业发展[M].北京：科学出版社，2001.

[2] 宋长春，何 岩，邓 伟.松嫩平原盐渍土壤生态地球化学[M].北京：科学出版社，2003.

[3] 李取生，李秀军，李晓军，等.松嫩平原苏打盐碱地治理与利用[J].资源科学，2003（1）：17-22.

[4] 周德庆，徐德强.微生物学实验教程[M].第三版.北京：高等教育出版社，2013.

[5] 姜朵朵.耐盐苯酚降解菌的筛选鉴定及其降解特性研究[D].镇江：江苏科技大学，2013.

[6] 米 琴，张玉琴，陈义光，等.青海盐环境下革兰氏阳性中度嗜盐细菌的分离及其生物学特性[J].陕西师范大学学报（自然科学版），2005，33（3）：86-90.

[7] 韦 娜，张前前，杜宗军，等.极端嗜盐菌Halomonas elogata的分离鉴定及其降解偶氮染料活性兰BRF的条件优化研究[J].环境科学学报，2012，32（9）：2091-2096.

[8] 程丽娟，薛泉宏.微生物学实验技术[M].西安：世界图书出版公司，2000.

[9] YOICHI K， MAKOTO O， TAKANORI I， et al. Varietal and seasonal differences in oxalate content of spinach [J]. Scientia Horticulturae，2003，97：203-210.

[10] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[11] 刘旭光，张 杰.分子生物学软件应用[M].北京：北京大学医学出版社，2007.

（责任编辑 彭西甜）

2.2.2 菌种生理生化鉴定 菌种A、B均能进行葡萄糖氧化产酸，在生长温度测定试验中均有浑浊，无沉淀物和悬浮物产生。生长物有穿刺线向四周呈云雾状扩散，表示菌种均有运动性。其他结果见表2。

2.2.3 扫描电镜观察 菌种A和菌种B都是杆状菌，菌种A和B的扫描电镜的照片见图1，照片的放大倍数是10 000倍。菌体大小分别为（1.0～1.5） μm×（0.5～1.0） μm和（0.5～2.0） μm×（0.5～1.5） μm，均无芽孢，无鞭毛。

2.2.4 菌种的分子鉴定 菌种A及菌种B的完整基因序列长度分别是1 452 bp和1 451 bp。将菌种A的16S rDNA基因序列与GenBank数据库中的数据比对发现该耐盐菌的基因序列与Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037同源性达到了99%。根据比对结果建立系统发育树，见图2。由分子鉴定结果可知，高效耐盐菌A属芽孢杆菌属。

将菌种B的16S rDNA基因序列与GenBank数据库中的数据比对，该菌基因序列与Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1同源性达99%。根据比对结果建立系统发育树，见图3。由分子鉴定结果可知，高效耐盐菌B属芽孢杆菌属。

2.3 菌种的生长特性研究

2.3.1 温度对菌种生长的影响 由图4可知，菌种A和B的最适生长温度均为30 ℃，温度升高至35 ℃时，菌液的浓度降低，菌种生长十分缓慢。

2.3.2 pH对菌种生长的影响 由图5可知，菌种A在pH为7～9时生长状态良好，pH为3～5时生长十分缓慢。菌种B在pH为7～9时生长情况较好，pH为12时仍能生长。综上所述，菌种A、B的最适pH值范围为7～9，强酸的条件不适合菌种的生长，强碱性的条件菌种能够生长。

2.3.3 盐浓度对菌种生长的影响 由图6可知，盐浓度为10%～15%时，菌种A和B生长缓慢，盐浓度为15%～25%时，菌种A和B生长迅速，盐浓度为25%～32%时，菌种A和B仍能生长，但生长缓慢，综上所述，菌种A和B耐盐范围比较大，可耐受较高盐浓度。

3 小结与讨论

1）以大庆盐碱地取得的土壤样本为菌源，利用采用牛肉膏蛋白胨培养基，稀释平板法分离纯化，最终筛选得到能够最高耐受盐浓度32%的菌种A和菌种B。

2）经一系列生理生化试验鉴定和16S rDNA测序比对，菌种A 为脱氮嗜盐芽孢杆菌（Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037），菌种 B 为咸鱼芽孢杆菌（Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1），菌种A和B均属芽孢杆菌属。

3）通过单因素试验可知，菌种A、B最优条件组合均为：温度30 ℃，pH在7～9，盐浓度20%。在此条件下，菌种生长最好。

参考文献：

[1] 刘兴土.松嫩平原退化土地整治与农业发展[M].北京：科学出版社，2001.

[2] 宋长春，何 岩，邓 伟.松嫩平原盐渍土壤生态地球化学[M].北京：科学出版社，2003.

[3] 李取生，李秀军，李晓军，等.松嫩平原苏打盐碱地治理与利用[J].资源科学，2003（1）：17-22.

[4] 周德庆，徐德强.微生物学实验教程[M].第三版.北京：高等教育出版社，2013.

[5] 姜朵朵.耐盐苯酚降解菌的筛选鉴定及其降解特性研究[D].镇江：江苏科技大学，2013.

[6] 米 琴，张玉琴，陈义光，等.青海盐环境下革兰氏阳性中度嗜盐细菌的分离及其生物学特性[J].陕西师范大学学报（自然科学版），2005，33（3）：86-90.

[7] 韦 娜，张前前，杜宗军，等.极端嗜盐菌Halomonas elogata的分离鉴定及其降解偶氮染料活性兰BRF的条件优化研究[J].环境科学学报，2012，32（9）：2091-2096.

[8] 程丽娟，薛泉宏.微生物学实验技术[M].西安：世界图书出版公司，2000.

[9] YOICHI K， MAKOTO O， TAKANORI I， et al. Varietal and seasonal differences in oxalate content of spinach [J]. Scientia Horticulturae，2003，97：203-210.

[10] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[11] 刘旭光，张 杰.分子生物学软件应用[M].北京：北京大学医学出版社，2007.

（责任编辑 彭西甜）

2.2.2 菌种生理生化鉴定 菌种A、B均能进行葡萄糖氧化产酸，在生长温度测定试验中均有浑浊，无沉淀物和悬浮物产生。生长物有穿刺线向四周呈云雾状扩散，表示菌种均有运动性。其他结果见表2。

2.2.3 扫描电镜观察 菌种A和菌种B都是杆状菌，菌种A和B的扫描电镜的照片见图1，照片的放大倍数是10 000倍。菌体大小分别为（1.0～1.5） μm×（0.5～1.0） μm和（0.5～2.0） μm×（0.5～1.5） μm，均无芽孢，无鞭毛。

2.2.4 菌种的分子鉴定 菌种A及菌种B的完整基因序列长度分别是1 452 bp和1 451 bp。将菌种A的16S rDNA基因序列与GenBank数据库中的数据比对发现该耐盐菌的基因序列与Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037同源性达到了99%。根据比对结果建立系统发育树，见图2。由分子鉴定结果可知，高效耐盐菌A属芽孢杆菌属。

将菌种B的16S rDNA基因序列与GenBank数据库中的数据比对，该菌基因序列与Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1同源性达99%。根据比对结果建立系统发育树，见图3。由分子鉴定结果可知，高效耐盐菌B属芽孢杆菌属。

2.3 菌种的生长特性研究

2.3.1 温度对菌种生长的影响 由图4可知，菌种A和B的最适生长温度均为30 ℃，温度升高至35 ℃时，菌液的浓度降低，菌种生长十分缓慢。

2.3.2 pH对菌种生长的影响 由图5可知，菌种A在pH为7～9时生长状态良好，pH为3～5时生长十分缓慢。菌种B在pH为7～9时生长情况较好，pH为12时仍能生长。综上所述，菌种A、B的最适pH值范围为7～9，强酸的条件不适合菌种的生长，强碱性的条件菌种能够生长。

2.3.3 盐浓度对菌种生长的影响 由图6可知，盐浓度为10%～15%时，菌种A和B生长缓慢，盐浓度为15%～25%时，菌种A和B生长迅速，盐浓度为25%～32%时，菌种A和B仍能生长，但生长缓慢，综上所述，菌种A和B耐盐范围比较大，可耐受较高盐浓度。

3 小结与讨论

1）以大庆盐碱地取得的土壤样本为菌源，利用采用牛肉膏蛋白胨培养基，稀释平板法分离纯化，最终筛选得到能够最高耐受盐浓度32%的菌种A和菌种B。

2）经一系列生理生化试验鉴定和16S rDNA测序比对，菌种A 为脱氮嗜盐芽孢杆菌（Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037），菌种 B 为咸鱼芽孢杆菌（Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1），菌种A和B均属芽孢杆菌属。

3）通过单因素试验可知，菌种A、B最优条件组合均为：温度30 ℃，pH在7～9，盐浓度20%。在此条件下，菌种生长最好。

参考文献：

[1] 刘兴土.松嫩平原退化土地整治与农业发展[M].北京：科学出版社，2001.

[2] 宋长春，何 岩，邓 伟.松嫩平原盐渍土壤生态地球化学[M].北京：科学出版社，2003.

[3] 李取生，李秀军，李晓军，等.松嫩平原苏打盐碱地治理与利用[J].资源科学，2003（1）：17-22.

[4] 周德庆，徐德强.微生物学实验教程[M].第三版.北京：高等教育出版社，2013.

[5] 姜朵朵.耐盐苯酚降解菌的筛选鉴定及其降解特性研究[D].镇江：江苏科技大学，2013.

[6] 米 琴，张玉琴，陈义光，等.青海盐环境下革兰氏阳性中度嗜盐细菌的分离及其生物学特性[J].陕西师范大学学报（自然科学版），2005，33（3）：86-90.

[7] 韦 娜，张前前，杜宗军，等.极端嗜盐菌Halomonas elogata的分离鉴定及其降解偶氮染料活性兰BRF的条件优化研究[J].环境科学学报，2012，32（9）：2091-2096.

[8] 程丽娟，薛泉宏.微生物学实验技术[M].西安：世界图书出版公司，2000.

[9] YOICHI K， MAKOTO O， TAKANORI I， et al. Varietal and seasonal differences in oxalate content of spinach [J]. Scientia Horticulturae，2003，97：203-210.

[10] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[11] 刘旭光，张 杰.分子生物学软件应用[M].北京：北京大学医学出版社，2007.

（责任编辑 彭西甜）