原料及发酵剂对苹果渣发酵饲料酵母菌活菌数及纯蛋白质含量的影响

■郭志英 郭 俏 来航线 薛泉宏

（西北农林科技大学资源环境学院，陕西杨凌 712100）

我国为苹果生产大国，年产量近2 000万吨，苹果汁加工中每年排出鲜苹果渣100多万吨。目前仅有少部分果渣被用于发酵饲料生产，其余部分直接烘干用作饲料原料。苹果渣含水量约80%，其干物质中蛋白质含量仅3%～5%，直接作饲料营养价值较低。但苹果渣中含有少量可溶糖、维生素及矿质元素，大量果胶质、纤维素及半纤维素等高分子碳水化合物等营养成分[1]，是微生物的良好营养基质。采用特定工艺通过微生物发酵可提高苹果渣中蛋白质含量，将苹果渣转化为营养丰富的蛋白质饲料，对缓解我国饲料蛋白资源缺乏，促进畜牧业发展具有重要意义。近年已有较多以苹果渣为原料生产蛋白饲料的发酵工艺研究[2-7]，其目的是提高发酵产物中的蛋白质含量，而其中对发酵产物中酵母菌活菌数的关注不多。酵母菌体及其代谢产物具有多种促生抗病功能[8-9]，因此发酵饲料中的酵母菌活菌数量也是影响发酵饲料营养品质的重要因素之一，目前对发酵产物中酵母菌活菌数量的研究不多。本文重点研究原料及发酵剂菌种组成对发酵产物中酵母菌活菌数及纯蛋白质含量的影响，旨在为苹果渣发酵饲料生产工艺优化及发酵产物营养品质综合评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

原料：苹果渣，由乾县海升果汁厂提供。豆粕，市场购买。

菌种：黑曲霉UA8（Aspergillas niger）、产朊假丝酵母C1314（Candida utilis，缩写为Cu）由西北农林科技大学资源环境学院微生物资源研究室提供。

菌种活化培养基：PDA固体培养基[10]。

1.2 方法

UA8孢子悬液制备：将活化好的UA8斜面管制成菌悬液，接入装有50 ml PDA固体培养基的三角瓶中培养3 d，向三角瓶中加100 ml无菌水（含0.5 g/l吐温与石英砂）用无菌刮铲刮取孢子，摇匀，血球板测得悬液的孢子数为3.7×108个/ml。

酵母菌Cu菌悬液制备：将活化好的Cu斜面管中加入少量无菌水制得菌悬液，转移到100 ml无菌水瓶中（含0.5 g/l的吐温与石英砂），摇匀，血球板测得菌菌悬液活菌数为3.9×108个/ml。

方案与操作：试验设A、B两个方案，以探索不同处理对发酵产物纯蛋白质含量及酵母菌数的影响。

A.原料影响：设3种发酵原料：苹果渣；苹果渣∶油渣为7∶3；苹果渣∶豆粕为7∶3。方法：向组培瓶中分别加入上述原料各15.00 g，4 g/l硫酸铵溶液40 ml，4层纱布包扎后，121℃灭菌40 min，冷却后接入菌悬液：单菌发酵接入5 ml Cu菌悬液或UA8孢子悬液，混菌发酵接入2.5 ml Cu菌悬液和2.5 ml UA8孢子悬液，用无菌竹签充分搅匀，包扎后28℃培养3 d，稀释平皿涂抹法测定发酵产物的酵母菌活菌数；同时用烘干法测定，40℃鼓风干燥后测定发酵产物含水量和纯蛋白质含量，酵母菌数测定结果及纯蛋白质含量均用干基表示。

B.混合发酵剂组成比例影响：设4种发酵剂组成，4种原料比例。发酵剂∶酵母菌∶黑曲霉为分别为0∶0；1∶1；10∶1；100∶1。原料：苹果渣∶油渣组成比例分别为10∶0；7∶3；8∶2；9∶1。方法：向组培瓶中分别加入上述干原料各15.00 g，4 g/l硫酸铵溶液40 ml，灭菌冷却后接入混合菌悬液5 ml（按不同比例先制得混合菌悬液），具体方法同方案A。上述所有处理均重复3次，测定结果用平均值表示。

发酵产物纯蛋白质含量测定：将烘干样品粉碎，过筛，称取0.300 0 g于小三角瓶中，加蒸馏水10 ml，在电炉上加热至微沸，维持15 min，加饱和的氯化钙1 ml，200 g/l磷酸氢二钾1 ml，待出现白色絮凝物后，充分摇匀过滤，再用10 ml蒸馏水洗涤滤纸上的样品，直至洗出液无铵离子(用钠氏试剂检验)，将滤纸连同滤物放入消煮管中，100℃烘干后各加入8 ml浓硫酸，以小漏斗盖住消煮管口，120℃碳化12 h后，用浓硫酸-过氧化氢法消煮完成后，选择适宜的稀释度用靛酚蓝比色法[11]测定氮的含量，乘以系数6.25换算成蛋白质含量。

发酵产物含水量测定：采用烘干称重法测定。

发酵产物活菌数测定：采用稀释平板涂抹法测数[10]。

结果计算：接入发酵剂处理较对照CK纯蛋白质增率用⊿ck表示；加入辅料（油渣或豆粕）处理较纯苹果渣对照纯蛋白质增率用⊿ap表示，分别用公式（1）、（2）计算。

⊿ck(%)=（接菌纯蛋白质含量-不接菌CK纯蛋白质含量）/接菌纯蛋白质含量×100 (1)

⊿ap(%)=（加辅料处理纯蛋白质含量-纯苹果渣纯蛋白质含量）/接菌纯蛋白质含量×100 (2)

2 结果与分析

2.1 原料组成及发酵剂对发酵产物酵母菌活菌数及纯蛋白质含量的影响（见表1）

2.1.1 原料组成

从表1看出，不同原料组成发酵产物酵母菌活菌数不同。混接Cu+UA8处理中，不同原料组成发酵产物酵母菌活菌数（108CFU/g）按苹果渣+油渣（188.1）＞苹果渣+豆粕（145.0）＞苹果渣（11.8）排列。由此可知，原料组成为苹果渣+油渣时，发酵产物中酵母菌活菌数为纯苹果渣的16倍。

表1 原料及发酵剂组成对发酵产物中酵母菌活菌数与纯蛋白质含量的影响

从表1还可看出，不同原料组成发酵产物蛋白质含量不同。混接Cu+UA8处理中，不同原料组成发酵产物蛋白质含量（g/kg）排序为：苹果渣+油渣（345.8）＞苹果渣+豆粕（271.7）＞苹果渣（246.9），苹果渣+油渣、苹果渣+豆粕处理的纯蛋白含量分别较苹果渣对照提高40.1%、10.0%；单接Cu与UA8时，纯蛋白质含量分别较苹果渣对照提高46.8%、20.4%与31.9%、6.3%，即加入辅料油渣处理的纯蛋白质增率大于加入辅料豆粕。

2.1.2 发酵剂

从表1看出，不同发酵剂处理发酵产物酵母菌活菌数不同。原料组成为苹果渣+油渣时，Cu+UA8混菌接种处理发酵产物中酵母菌活菌数为188.1×108个/g，而单接Cu处理中酵母菌仅为3.6×108个/g，混接处理酵母菌数为单接的52倍；在苹果渣+豆粕处理中，Cu+UA8混菌接种处理发酵产物中酵母菌活菌数为单接Cu处理的121倍。在纯苹果渣中亦有类似趋势。即混菌发酵剂处理发酵产物中的酵母菌活菌数远高于酵母菌单独接种。

从表1看出，不同发酵剂接种处理发酵产物中纯蛋白质含量不同。原料组成为苹果渣+油渣时，发酵产物蛋白质含量（g/kg）按混接Cu+UA8（345.8）＞单接UA8（320.3）＞单接Cu（312.5）排列；其它两种原料组成蛋白质含量排序与之类似。由此可知，混接Cu+UA8处理发酵产物中纯蛋白质含量较高，在苹果渣、苹果渣+油渣及苹果渣+豆粕原料中，混菌接种较不接菌对照纯蛋白质含量分别提高36.0%、37.8%及26.1%。

2.2 发酵剂及原料配比对发酵产物酵母菌活菌数及纯蛋白质含量的影响（见表2）

表2 原料组成及混接比例（Cu∶UA8）对发酵产物中酵母菌活菌数及纯蛋白质含量的影响

2.2.1 原料配比

从表2看出，苹果渣与油渣配比不同时，发酵产物中酵母菌活菌数不同。Cu与UA8按1∶1比例混接时，不同原料配比发酵产物中的酵母菌Cu活菌数（106个/g）按苹果渣∶油渣9∶1（301）＞8∶2（92）＞7∶3（36）＞单纯苹果渣（1.9）排列。Cu与UA8按10∶1；100∶1混接时，Cu的菌数排序与之类似。添加油渣后酵母菌活菌数明显高于单纯苹果渣发酵，其中苹果渣与油渣比例为9∶1时酵母菌活菌数较多。由此可知，适当添加少量油渣量可使发酵产物中酵母菌活菌数大幅度增加。

从表2看出，不同原料配比发酵产物纯蛋白质含量不同。Cu与UA8按10∶1比例混接时，不同原料配比发酵产物中纯蛋白质含量（g/kg）按苹果渣∶油渣8∶2（309.6）＞7∶3（291.5）＞9∶1（281.7）＞10∶0纯苹果渣（194.8）排列；Cu与 UA8混接比例为1∶1和100∶1时，蛋白质含量排序与之大致相似。由此可看出，添加油渣后发酵产物中纯蛋白质含量大幅度增加，但不同配比之间差异不大。

2.2.2 发酵剂菌种组成比例

从表2看出，发酵剂菌种组成比例不同，发酵产物中酵母菌活菌数不同。原料组成为单纯苹果渣时，不同混接比例下，发酵产物酵母菌Cu活菌数（106个/g）按Cu∶UA8混接比例10∶1（101.1）＞100∶1（19.2）＞1∶1（1.9）排列；添加油渣后亦表现为混接比例10∶1时发酵产物酵母菌活菌数较多。由此可知，适当加大酵母菌的接种量（Cu∶UA8=10∶1）能提高发酵产物中酵母菌活菌数。

从表2还可看出，发酵剂菌种组成不同时发酵产物纯蛋白质含量不同。原料为纯苹果渣时，混合发酵剂中菌种混合比例不同，发酵产物纯蛋白质含量（g/kg）差异不大，如Cu∶UA8为1∶1；10∶1及100∶1时，发酵产物纯蛋白质含量（g/kg）分别为177.5、194.8及185.0，较不接菌对照分别提高24.9%、37.1%及30.2%，表现为Cu∶UA8为10∶1时效果最好；在添加油渣后原料配比为8∶2，Cu∶UA8为1∶1；10∶1及100∶1时，发酵产物的纯蛋白质含量分别较不接菌对照提高15.9%、26.4%及6.0%，亦表现出Cu∶UA8为10∶1时纯蛋白质增幅最大。

3 讨论

本研究结果表明，在苹果渣与油渣或者豆粕的不同原料组合中，混接处理的发酵产物中酵母菌细胞数及纯蛋白质含量均高于单接酵母菌处理。其原因在于黑曲霉UA8产生的纤维素酶、蛋白酶及果胶酶等水解酶类可将苹果渣中的纤维素、果胶等碳水化合物及蛋白质水解为小分子糖及氨基酸等，为酵母菌的生长提供充足的碳能源、氮源及生长因子等，促进了酵母菌大量繁殖，进而导致发酵产物中酵母菌活菌数及菌体蛋白质大幅度提高。混合菌剂中，当黑曲霉所占比例过高（Cu∶UA8=1∶1）或过低Cu∶UA8=100∶1）时，或因混菌发酵体系中黑曲霉大量生长，通过营养及空间竞争抑制酵母菌繁殖，或因接入的黑曲霉量过少，影响苹果渣中大分子碳水化合物水解为小分子糖类，造成营养不足，均可导致发酵产物中酵母菌数量较少。

另外，本研究结果表明，以同样的比例向苹果渣中加入油渣及豆粕时，添加油渣处理的酵母菌数与纯蛋白质含量均高于豆粕，其原因与油渣中植物蛋白质含量较高，在黑曲霉产生的多种水解酶作用下形成的小分子氨基酸类物质，对酵母菌生长繁殖更为有利，所形成的酵母菌细胞及菌体蛋白均多有关。

目前，对苹果渣发酵饲料的研究主要集中于提高发酵饲料中蛋白质含量的工艺优化及氨基酸变化[12-16]，但对发酵产物中酵母菌活细胞数关注不多，进而影响了对发酵产物营养价值的综合评价。酵母菌细胞中含有丰富的多种营养成分及B族维生素等活性成分，对动物具有直接营养作用，能促进肠道微生物繁殖并增强其活性，稳定胃肠道微生物区系，具有强化营养，提高免疫力和抗病促生功能；酵母菌细胞壁中大量存在的β-葡聚糖和甘露寡糖具有多种免疫功能[8-9]。因此，发酵产物中的酵母菌细胞数量也是发酵产物营养品质的重要指标之一，该指标可反映发酵过程中酵母菌的繁殖量及其各种活性代谢产物累积量。本研究还发现，苹果渣发酵产物中酵母菌活菌数与纯蛋白质含量具有相同的变化趋势，即能提高纯蛋白含量的工艺措施对酵母菌活菌数有同样的增加作用。该结果将为苹果渣固态发酵工艺优化提供重要的实验依据，并为发酵产物营养品质综合评价提供科学依据。

4 结论

在苹果渣中添加油渣和豆粕，采用酵母菌与黑曲霉混合发酵均能显著同步提高发酵产物中酵母菌活菌数及纯蛋白质含量。其中添加油渣处理效果优于豆粕，且苹果渣与油渣比例为9∶1时，发酵产物中酵母菌活菌数及纯蛋白质含量均较高；采用混合发酵剂时，发酵产物中的酵母菌数量均高于酵母菌单独接种，且适当加大酵母菌接种量能大幅度提高发酵产物中酵母菌活菌数和纯蛋白质含量，当酵母菌∶黑曲霉为10∶1比例时，发酵产物中的酵母菌活菌数及纯蛋白质含量均最高。