氧化应激对动物肠道损伤及硫辛酸干预作用的研究进展

■ 鲍伟光 王占彬 顾宪红 郝 月 崔艳军

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室，北京 100193；2.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471003）

生物体在代谢过程中，会产生大量的自由基，这些自由基通常不会导致组织细胞的损伤，机体自身依靠体内的抗氧化防御系统，主要包括抗氧化酶类和非酶类的抗氧化剂，可以保护机体组织和细胞，防止自由基造成的损伤[1-4]。当机体细胞内产生的自由基的水平高于细胞的抗氧化防御能力时，氧化还原状态失衡，过量的自由基存在于组织或细胞内，即诱发氧化应激，并导致氧化损伤[5]。器官和组织对氧化应激的易感性依赖于它的抗氧化系统的状态和氧化与抗氧化在细胞内的动态平衡。

肠道作为一个机体与外界相通的器官。不仅是体内重要的营养物质消化、吸收、免疫和内分泌器官，还可以阻止肠腔内的毒素、细菌、抗营养因子等有害物质进入体内对机体造成损伤，起到一个重要的屏障功能[6]。肠道时刻与外界相通，接触外界微生物的次数也最多，因此也更容易产生氧化应激，造成氧化损伤。

硫辛酸（lipoic acid，LA）作为一种高效的抗氧化剂可以减少活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，减弱DNA的氧化损伤，抑制脂质过氧化，并能很大程度地改善体内抗氧化防御系统，对氧化应激引起的疾病有显著的缓解作用[7]，在生物体内可以转化为还原型的二氢硫辛酸，并能够再生为内源性抗氧化剂，LA具有双硫五元环结构，具有显著的亲电性和与自由基反应的能力。近几年，国内外学者深入研究肠道氧化损伤的机制，根据氧化损伤理论开发有针对性的饲料添加剂已成为研究热点之一。

1 自由基与氧化应激

20世纪30年代，氧自由基（oxygen derived free radicals，OFR）首先被Pauling发现并将其命名为超氧化物[8]。随后，Mann等[9]从牛血液和肝脏纯化出超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），命名为“erythrocuprein”，“hepatocuprein”或“cytocuprein”，并证明是未知功能的铜结合蛋白，纯化物完全基于铜的含量。当时并不知道OFR能在动物机体中产生，并可能导致各种疾病。直到20世纪60年代末，OFR才逐渐被大家所认识，1968年McCord等[10-11]发现红细胞SOD能够清除“Pauling自由基”，并提出SOD存在于几乎所有的哺乳动物细胞中，还发现超氧阴离子（O2·-）是动物机体正常的代谢产物。1973年Babior等[12]发现，一些与炎性反应过程相关的组织损伤可以归因于嗜中性粒细胞产生的O2·-，并且证明SOD具有保护细胞损伤的作用。1981年Granger等[13]研究表明，缺血/再灌注猫的肠组织损伤是由过多的ROS产生引起的。随着人们对自由基的不断探索，氧化应激也逐渐被大家所重视。

1.1 OFR及ROS产生途径

自由基是指单独存在的，具有不配对价电子的离子、原子、分子基团。ROS是指氧的一些代谢产物和某些反应的含氧产物，其特点是含有氧元素，化学性质较氧分子活泼。ROS中的一些是自由基，其不配对的电子位于氧，称为OFR；另一些则是非自由基的含氧物，非自由基ROS的特点是可以在自由基反应中产生，同时还可以直接或间接地触发自由基反应。在生命活动的氧化代谢过程中会不断地产生各种OFR，其中O2·-、羟自由基（·OH）和羧自由基（ROO·）是三种具有代表性的自由基。O2·-形成最早，而·OH作用最强。自由基的产生途径如图1所示。

图1 ROS产生途径

1.2 氧化应激的概念及危害

氧化应激是指机体或细胞内OFR的产生和消除的平衡被打破，或外源性氧化物质过量摄入，导致ROS在体内或细胞内过量蓄积，引起细胞毒性的病理过程，是心肌缺血/再灌注损伤的重要原因之一[14]。氧化应激通过其氧化过程调节生理过程和生化反应，同时也造成细胞、亚细胞结构、生物大分子的氧化损伤，因此同时涉及到广泛的生理和病理过程。袁施彬[15]通过给仔猪饲喂氧化鱼油和腹腔注射diquat都可诱导氧化应激，建立氧化应激的动物模型，其氧化应激效应表现为生产性能和养分利用率降低，组织抗氧化酶活力和总的抗氧化能力下降，血相也有相同的改变，组织细胞脂质、DNA过氧化损伤加剧，机体免疫能力下降。李丽娟[16]研究发现氧化应激引起肠黏膜损伤，使肠黏膜标志酶碱性磷酸酶、钠钾ATP酶、蔗糖酶活性极显著下降，引起肠系膜BBMV和BLMV葡萄糖转运能力极显著下降。Deng等[17]的研究发现，氧化应激能够显著影响仔猪的免疫能力。氧化应激能够破坏肠道屏障功能，引起仔猪腹泻，同时造成仔猪消化吸收功能的下降。Tanida等[18]研究表明，自由基能够攻击肠黏膜蛋白，造成养分转运载体、消化酶等一些重要的功能性蛋白活性降低甚至丧失。Kawauchiya等[19]发现氧化损伤导致肠上皮细胞紧密连接相关的蛋白质表达量下降。Circu等[20]利用脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）诱导肠道细胞发生调亡，造成肠道屏障功能降低，损伤肠道的消化吸收功能。

1.3 机体的抗氧化系统

机体处于正常状态时，体内的氧化-抗氧化系统处于平衡状态，体内自由基的产生能够得到及时的清除，所以其含量就会比较稳定，反之则会异常。机体的抗氧化系统包括：抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT等）和非酶类抗氧化物质（维生素E、维生素C、有机硫化物等）。Ansaldo等[21]研究鱼的消化腺体在不同剂量机油污染造成的氧化应激试验中，测定抗氧化酶、氧化损伤和它们的适应能力，结果表明SOD、CAT和GST的活性随机油剂量的增加而增加，GSH-Px活性增加极显著。

2 氧化应激与肠道损伤

肠道黏膜完整性的维持主要由谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物（GSH/GSSG）和半胱氨酸/胱氨酸（Cys/CySS）偶联的氧化还原状态调控，当它们处于正常状态时，肠道才能保证营养物质的正常吸收、黏液层的正常流动和肠道微生物的多样化。OFR导致消化道疾病的主要原因是：①OFR直接作用细胞的大分子；②OFR作为细胞内信息转导信号诱发细胞浆内核转录因子（如NF-κB）激活，引起核内有关的基因转录增加，是很多急性、慢性炎症、细胞凋亡及免疫失调等疾病发生发展的分子生物学基础。

2.1 氧化应激对肠道氧化还原状态的影响

在机体内环境中，脂质、蛋白质和核酸是OFR攻击的主要目标。过氧化反应可以使脂质、蛋白质、核酸的功能丧失，从而影响细胞膜的完整性、酶的活性、受体、转运蛋白等蛋白质和核酸的正常功能[22]，并可引起衰老、肠炎等一系列疾病。氧化还原信号的传递是具有特异性的，单个氧还原体系分别独立存在于线粒体、细胞核、内质网和细胞质基质中。任何一个氧化还原体系被破坏就会导致肠道黏膜的氧化应激，进而导致肠道病变。陈群等[23]研究表明，小肠上皮细胞添加GSH后使得SOD和CAT的酶活性一定程度地提高，主要是GSH清除了部分自由基，使得自由基钝化抗氧化酶能力减弱。Srigiridhar等[24]的研究发现，铁可以导致肠道MDA和蛋白质羰基含量显著升高。Troost[25]、张志浩[26]也有类似研究。宋小珍等[27]在断奶仔猪上的研究表明，氧化应激使猪肠道SOD、GSH-Px的含量显著降低，而MDA的含量显著上升。Zhang等[28]的研究结果表明，LPS引起的氧化应激可以导致肉鸡GSH-Px、T-SOD活性降低和MDA含量增加。从这些文献可以看出，氧化应激破坏了动物肠道氧化-抗氧化平衡状态，使肠道氧化酶活性改变，因此检测肠道中SOD、GSH-Px、T-SOD、MDA等的含量可以间接的评价动物肠道损伤的程度。

2.2 氧化应激对肠道完整性的影响

肠道屏障的完整性通常用肠道通透性和细菌移位来表示。肠道通透性是指某些分子物质通过简单扩散方式穿过肠道黏膜上皮的难易程度。当肠道屏障受到损伤尤其是紧密连接受到损伤时，肠道的通透性就会立刻升高。细菌移位是指肠道内的细菌从肠道黏膜转移到血液和免疫淋巴结的过程，一般用单位肠系膜和脾脏匀浆后培养细菌的菌落数来表示。常用以下方法来评价肠道的完整性：①观察肠道组织切片，检测肠道绒毛高度、隐窝深度；②检测血浆中LPS和D-乳酸水平；③检测紧密连接蛋白（occludin）和胞质蛋白（ZO-1）表达量。

动物肠道绒毛是机体消化吸收养分的主要部位，绒毛结构的改变将直接影响营养物质的消化和吸收。赵立柯等[29]研究表明，氧化应激引起肠道绒毛高度降低，隐窝深度加深，从而导致肠道消化吸收能力的下降。Bollengier等[30]的研究指出，氧化应激使幼龄母鸡的空肠绒毛高度、绒毛表面积和绒毛体积显著降低，从而影响肠道的功能；宁章永等[31]也有类似发现，试验结果表明氧化应激导致肉鸡的肠道发生了病理学变化，肠道的形态学结构受到了严重破坏，绒毛出现断裂、充血、缺失等现象。因此，通过观测肠道切片可以直接评价肠道的完整性。除此之外，检测血浆中LPS和D-乳酸水平也能间接的评价肠道的完整性[32]。

紧密连接是肠上皮细胞间的主要连接方式，在维持肠上皮细胞极性和调节肠黏膜屏障的通透性中发挥着重要的作用。Furuse等[33]认为occludin是集中在肠道紧密连接上的跨膜蛋白，并在细胞膜的外侧与ZO相连，形成occludin-ZO蛋白结合体，从而发挥其生理功能。段云等[34]研究表明，高原缺氧对肠黏膜屏障有损害作用，降低了occludin的蛋白表达量；于玮等[35]研究指出氧化应激状态下鸡肠道occludin蛋白表达量显著下降；Han等[36]研究指出低氧状态下激活TLR4/NF-κB信号通路，构成紧密连接复合体主要成分occludin蛋白表达量下调。呙于明等[32]也有类似的研究结果。通常情况下，occludin的蛋白表达量作为评价肠道通透性的重要指标。

2.3 氧化应激激活TLR4/NF-κB信号通路引起肠道细胞凋亡的研究

Toll受体4（toll-like receptor 4，TLR4）作为肠道固有免疫的重要组成部分，连同肠绒毛构成了肠道对细菌识别的第一道屏障，它既是细胞表面免疫识别受体，又是胞内跨膜信号传导分子。在氧化应激引起的肠源性败血症发展过程中，LPS是肠道上皮细胞TLR4的强效激动剂，当TLR4与特异性配体LPS结合后，可通过MyD88依赖和TRIF依赖的两条途径，激活IRAKs、TRAFs、TAK1等细胞内信号分子并最终激活通路下游的核因子κB（NF-κB）从基因水平调控TNF-α、caspase-3、IL-1β、IL-2、IL-8等多种炎症介质的表达[37-39]，在局部可引起肠黏膜上皮细胞凋亡，参与肠道组织器官的损伤，同时又可以作用于远隔器官，引起更大范围的全身炎症反应。

Fukata等[40]研究发现TLR4可以促进上皮细胞增殖并抑制肠道细菌的移位，但同时实验证明[41-42]，TLR4缺陷小鼠与野生型小鼠相比，结肠炎所致的肠道上皮损伤程度减轻，细胞因子及巨噬细胞、中性粒细胞浸润减少。Soares等[43]研究表明，TLR4可能在肠道损伤后细菌移位引发的炎症反应中起到至关重要的作用。La Serre等[44]报道指出，肥胖易感的SD大鼠在高脂饮食喂养后肠道TLR4表达上调，并伴随着occludin在细胞层面上的重新分布，免疫组化显示occludin从胞膜转移到胞质致使增加，进而引起屏障功能的损伤。由此可见，研究氧化应激激活TLR4/NF-κB信号通路引起的肠道屏障功能损伤和细菌移位以及肠道细胞凋亡具有重要的意义。

3 LA对动物肠道氧化损伤的干预作用

LA又名二氢硫辛酸，系统命名为1，2-二硫戊环-3-戊酸，分子式为C8H14O2S2，相对分子质量为206.33；通常为白色晶体，略有异味；分子中只有一个手性碳，具有旋光性。LA具有双硫五元环结构，具有显著的亲电性和与自由基反应的能力。其结构如图2所示。

图2 LA结构式

3.1 与金属离子络合

Cu2+、Hg2+等过渡金属离子及砷等元素在机体的氧化反应过程中起催化作用，如果过量摄入容易导致组织损伤[45]。LA及二氢硫辛酸可以与这些金属离子络合，阻断其催化作用，降低机体的氧化作用，抑制自由基的形成。研究表明[46]，当LA与砷的摩尔比为8∶1时，可以完全防止小鼠砷中毒。

3.2 修复受损细胞

LA不仅对长时间的氧化损伤有较强抵抗作用，而且对VC和VE不能修复的、较严重的细胞氧化损伤也可进行有效修复[47]。并且由于LA具有脂溶性，二氢硫辛酸具有水溶性，二者结合可以深入到细胞中的各个部位而起作用，而只具有脂溶性或水溶性的抗氧化剂却没有这一功能。

3.3 影响基因表达

NF-κB是一种能与免疫球蛋白κ链基因的增强子κB序列特异性结合的核蛋白因子，LA和二氢硫辛酸能够调节NF-κB的激活。并且LA能够阻止HIV复制，影响C-fos类原癌基因的表达，对自由基代谢过程中的中间产物H2O2造成的细胞DNA氧化损伤具有明显的保护作用[48]。

3.4 LA修复动物肠道氧化损伤

Guven等[49]报道，LA可以通过清除ROS和RNS对大鼠小肠缺血性再灌注损伤进行修复。李军华等[50]报道，LA通过抗氧化作用对UC大鼠具有保护作用。王艳艳等[51]指出，高脂日粮引起的小鼠氧化应激及消化系统功能障碍可以通过LA进行缓解。王啸春等[52]报道，LA能够修复OFR引起的大鼠小肠上皮细胞损伤。李武等[53]研究表明，LA通过直接清除自由基以及提高抗氧化通路相关功能基因的表达水平解除氧化应激而有助于防治高脂引发的肠道功能损伤。在氧化应激诱导的细胞损伤的通路中，细胞膜电位下降，Caspase-3激活、CytC释放、Bax和Bcl-2等的表达引起广泛关注。Powell等[54]报道，小肠细胞系DLD-1高糖损伤组的GSH浓度与对照组相比明显降低，添加LA后细胞中GSH含量恢复正常；同时发现高糖损伤组iNOS启动子基因表达上调，而LA损伤修复组显著降低了iNOS启动子表达上调量，在转录水平证明了LA对小肠细胞氧化损伤的修复作用。

LA可以通过减轻免疫抑制力，调整氧化应激下肠道菌群来减少肠道氧化损伤。张蓉等[55]研究指出，小鼠消化道氧化应激引起肠道微生物区系的紊乱，LA可以通过调整肠道氧化还原状态使微生物区系恢复正常。Cui等[56]进一步从肠道免疫细胞受体基因表达量验证LA的抗氧化作用，高脂饲粮能引起慢性氧化损伤，抑制肠道相关淋巴细胞的信号转导，导致了对黏膜免疫力的抑制，而LA能够通过从转录水平修复相关基因，肠道氧化损伤和免疫抑制反应。这些结果表明具有脂水两亲特性和高效抗氧化能力的LA，为LA作为饲料添加剂的进一步开发提供了自由基生物学方面的根据，已成为肠道氧化损伤干预机理研究较为成熟的一种抗氧化剂。

4 小结

近年来，动物的健康和福利受到了越来越多的关注，科学家们为此提出了研究应激的新模型。氧化应激作为动物胃肠道疾病的诱因也备受人们的关注，研究氧化应激对动物胃肠道损伤的机制机理已成为当今的热门课题，同时，进一步开发实用的饲料添加剂以有效地缓解氧化应激显得尤为重要。