鱼粉国标中氨基酸指标的快速检测方法

■李 丰 叶竹林 郑卫红 赖彩冰 彭志通

（广州汇标检测技术中心，广东广州 510300）

鱼粉是一种必需氨基酸种类相当平衡的优质动物性蛋白质原料，可通过氨基酸分析对鱼粉的质量予以评价[1-2]。鱼粉氨基酸分析首先要用不同的水解方式将肽链打开。目前最常用的水解方式是GB/T 18246—2000中的常规水解法和微波水解法。常规水解法是使蛋白质在盐酸的作用下，经液氮或干冰冷冻，抽真空后封口，再放入恒温干燥箱中，水解22～24 h后形成单一氨基酸[3]。此过程步骤繁琐，耗时长，劳动强度大且处理过程中部分氨基酸易损失。微波水解是使用微波炉在2 450 Hz的微波电磁场的作用下，微波通过试样及盐酸时，极性分子随微波频率快速变换取向，分子来回转动，与周围分子相互碰撞，分子的总能量增加，使试样温度急剧上升。这种加热方式与传统的加热方式相比具有操作简单、样品水解快、节约能源、工作效率高和劳动强度小等优点[4-5]。因此，研究微波水解法快速测定鱼粉氨基酸的含量，有助于提高检测效率。有笔者也对微波水解法测定鱼粉中氨基酸进行了研究[4]，从微波水解法的快速、准确方面入手，得出研究数据。但是并没有考察微波水解法最佳条件及检测结果的稳定性。本研究根据蛋氨酸和赖氨酸含量的高低可以判断鱼粉质量的优劣[6]，从鱼粉蛋氨酸和赖氨酸含量测定方面入手，考察微波水解法最佳条件及检测结果的稳定性。本研究拟通过正交设计选择微波水解的最佳条件并在一定时期内探讨微波水解的稳定性，同时与常规水解方法相比较，以探索微波水解快速测定氨基酸的可行性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

鱼粉样品为市售进口鱼粉；16种氨基酸混标（Sigma）；巯基乙醇（Sigma）、茚三酮（Sigma）、乙腈（Merck）、甲醇（Merck）、纯净水（实验室自制）,其他试剂均为分析纯。

氨基酸分析仪（日立L-8900）、EZChromtion工作站、电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9030A，上海一恒）、电子天平（EL104，梅特勒）、氮吹仪（N-Evap，Organomation）、微波消解仪（mutiwave GO，安东帕）。

1.2 试验方法

1.2.1 微波水解正交试验设计

采用L9(34)四因素三水平正交试验。因素水平见表1。

表1 微波水解鱼粉的因素水平设计

1.2.2 微波水解稳定性试验设计

鱼粉的微波水解氨基酸稳定性考察时间为3个月。样品保存于0～4℃冰箱冷藏柜中备用。按所选择的最佳微波水解条件，分别于2015年3月5日、3月18日、4月9日、4月21日、5月11日、5月29日对鱼粉的氨基酸含量进行测定。

1.2.3 试验操作

1.2.3.1 微波水解鱼粉

称取约20 mg鱼粉，放入水解罐中，加入6 mol/l盐酸溶液0.5 ml，抽真空，再充入高纯氮以排净空气。密封放入微波炉中，按正交试验设计拟定微波水解条件设置微波炉，开始水解。水解结束后冷却至常温，开罐，过滤入25 ml容量瓶，用去离子水定容。摇匀后移取一定量溶解液至旋转蒸发仪中，旋转蒸干，以0.02 mol/l HCl溶解蒸发的剩余物，定容至100 ml容量瓶中，摇匀，以注射器吸取后通过滤膜，抽滤入专用进样瓶。最后上机分离、测定。所有样品重复4次测定，结果取平均值。

1.2.3.2 常规水解鱼粉

样品前处理参考GB/T 18246—2000中酸水解法，其余步骤同微波水解。所有样品重复4次测定，结果取平均值。

2 结果与讨论

2.1 正交试验结果分析（见表2～表4）

表2 微波水解鱼粉中蛋氨酸结果

表3 微波水解鱼粉中赖氨酸结果

表4 常规水解鱼粉结果

综合表2～表4的试验结果可知，微波水解法3个因素的主次顺序为：B→C→A，与常规水解结果相比可得微波水解最佳组合为：A1B2C2，即在巯基乙醇含量0.5%，160℃下水解20 min。

正交试验方差分析结果：赖氨酸FB=5.789＞F0.05(2，6)、FA=0.196 4＜F0.10(2，6)、FC=0.42＜F0.10(2，6)；蛋氨酸FA=0.733＜F0.10(2，6)、FB=0.318＜F0.10(2，6)、FC=0.236＜F0.10(2，6)。方差分析表明：B因素对鱼粉的赖氨酸有显著性影响，A和C因素对鱼粉赖氨酸无显著性影响；A、B、C 3个因素对鱼粉的蛋氨酸均没有显著性影响。

2.2 微波水解稳定性分析

6次微波水解稳定性结果见表5。从表5可知，鱼粉在为期3个月的试验过程中，参与比较分析的2种氨基酸结果的RSD值均小于1.0%。经F检验，同一鱼粉样品在不同时间的赖氨酸和蛋氨酸含量测定结果均不存在显著差异(F＜F0.10)。

表5 鱼粉微波水解稳定性结果（%）

2.3 常规水解法和微波水解法测定结果比较

①微波辅助水解法与常规水解法进行比较，结果见表6。两种水解方法测定结果的相对偏差均小于2.0%，符合国家标准GB/T 18246—2000《饲料中氨基酸的测定》规定要求，经F检验，微波辅助水解法与常规水解法测定结果不存在显著差异(F＜F0.10)，在所选择的最佳条件下微波水解法测定结果与常规水解法一致。

表6 微波水解与常规水解结果对比(%)

②在微波水解过程中，由于高压和高温，具有极性侧链的氨基酸，如苏氨酸、丝氨酸等易被破坏，回收率比较低，所以在考虑用微波水解法测定氨基酸含量的同时要考虑到个别氨基酸的含量测定偏低问题。

3 结论

①从以上结果分析可知，微波水解的最佳条件是巯基乙醇含量0.5%、温度160℃、水解时间20 min；通过比较分析3个月内鱼粉氨基酸结果的变化情况，证明微波水解法的稳定性较好。

②微波水解法与常规水解法在测定时间上差别较大，常规水解法至少水解22 h，而微波水解最多只需20 min，因为微波水解的加热方式与常规水解的加热方式截然不同，除了分子间的来回运动升温，试液中的带电粒子在交变的电磁场中受电场力的作用而来回迁移运动，也会与临近分子撞击，使试样温度升高，从而加快了水解速度，使工作效率提高了20倍以上。

③微波水解法与常规水解法在所用实验仪器上，常规水解需要仪器设备较多，操作繁琐且劳动强度大。而微波水解只需微波消解炉，操作简单。

综上所述，微波水解法具有操作简捷、方便、快速，不但节约了试剂，更节约了能源，大大提高了工作效率而且测定结果准确、可靠。因此，可应用于鱼粉国标中氨基酸的快速测定。