培美曲赛二钠与奥沙利铂在Beagle犬体内的药动学相互作用

郑 鑫，李 茜，尤海生，于 佳（西安交通大学第一附属医院，西安 710061）

培美曲赛二钠与奥沙利铂在Beagle犬体内的药动学相互作用

郑 鑫，李 茜，尤海生，于 佳（西安交通大学第一附属医院，西安 710061）

目的 探讨在Beagle犬体内，培美曲赛二钠和奥沙利铂联合用药前后药动学变化规律。方法 采用自身对照随机交叉法，将9只Beagle犬随机分成培美曲赛二钠组、奥沙利铂组以及培美曲赛二钠和奥沙利铂联合给药组，经静脉给药后，于不同时间点采集血样，LC－MS／MS法测定二者的血药浓度，DAS3.2.1统计矩法计算药动学参数，AUC和Cmax用“生物等效性与生物利用度”模块下的90%可信区间法进行统计。结果 与单独给药比较，联合使用培美曲赛二钠和奥沙利铂的主要药动学参数t1／2、CLint和MRT均无显著性差异（P＞0.05）；药物单用与合用组的AUC和Cmax在90%可信区间的生物等效性统计结果合格，tmax检验结果差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 Beagle犬同时注射培美曲赛二钠和奥沙利铂不存在显著的药动学相互作用。

培美曲赛二钠；奥沙利铂；药动学相互作用

培美曲赛二钠（pemetrexed disodium）是一种结构上以吡咯嘧啶基团为核心的抗叶酸药物，它可以作用于叶酸代谢过程的多个酶，包括胸苷酸合成酶（TS）、二氢叶酸还原酶（DHFR）和甘氨酰胺核苷酰基转移酶（GARFT）等，可以从多个途径抑制嘧啶和嘌呤的合成，造成叶酸代谢和核苷酸合成过程的异常，通过破坏细胞内这些依赖性的正常代谢过程，抑制细胞复制，从而抑制肿瘤的生长［1－2］。临床前及临床研究证实，其有明确的抗多种实体肿瘤的活性，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等，对恶性胸膜间皮瘤（MPM）的治疗尤为有效，具有良好的疗效和轻微的毒副作用［3－4］。铂类金属药物是当前抗肿瘤药物最为活跃的研究开发领域之一。铂类配合物具有许多独特的理化性质，其在肿瘤治疗方面的疗效显著，被广泛应用于临床，成为肿瘤联合用药方案中的重要组成部分。统计数据表明，我国所有的化疗方案中有70%～80%以铂类为主或有铂类药物参与配伍［5］。奥沙利铂（草酸铂，oxaliplatin，L－OHP）是继卡铂、顺铂后的第三代铂类广谱抗癌药物，是一种突破性的、独特的铂类化合物，毒性较低，使用安全性良好［6］，主要是使肿瘤细胞内DNA形成链间和链内交连，从而中断DNA合成，最终产生细胞毒和抗肿瘤活性［7］。目前，奥沙利铂已成为治疗结肠、直肠癌的一线药物［8］，与培美曲赛二钠联合应用治疗恶性间皮瘤、晚期非小细胞肺癌、晚期胃癌、结肠癌、晚期肺腺癌等受到推崇，可明显延长患者的生存时间并改善症状［912］。本实验采用LC－MS／MS法检测，首次探讨了培美曲赛二钠和奥沙利铂联合用药时的药动学相互作用，为临床用药提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC－30A高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；Xevo TQ质谱仪（美国Waters公司）；Xw－80A旋涡混合器（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；ME104电子天平（瑞士梅特勒－托利多集团）；Sigma 13K15高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；Elix 20水纯化系统（18.2M，德国MERCK MILLIPORE公司）。

1.2 试药 培美曲赛二钠对照品（上海酶联生物科技有限公司，批号100897－200601，规格：100mg，质量分数：98%以上）；奥沙利铂对照品（中国食品药品检定研究院，批号100584－200401）；注射用培美曲赛二钠（江苏奥赛康药业有限公司，批号080901，规格：0.5g／支）；注射用奥沙利铂（扬州奥赛康药业有限公司提供，批号20091202，规格：50mg／支）；甲酸、乙腈（色谱纯，美国J.T.Baker公司）；去离子水（18.2MQ，实验室自制）；其他试剂为分析纯。

1.3 动物 健康成年Beagle犬，普通级，体质量12±2kg，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

2 实验方法

2.1 色谱和质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Shim－pack XR－ODS（100 mm×2.0mm，2.2μm）；保护柱：Shim－pack GVPODS（2.0mm×5mm，2.2μm）；流动相为A相（0.02mmol·L－1醋酸铵，pH3.6）和B相（乙腈），采用梯度洗脱方式；柱温40℃；流速：0.6mL·min－1；进样量：30μL。

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾离子源：离子喷雾电压为4.6kV；毛细管温度为450℃；雾化气压55psi；辅助气压为60psi；气帘气压为30psi。定量分析监测的离子对为：培美曲赛二钠m／z 536→336，碰撞电压为35V；奥沙利铂m／z 435→125；内标顺铂m／z 468→212，碰撞电压为45V。

2.2 标准储备液的配制 精确称取培美曲赛二钠和奥沙利铂对照品各10mg，置于10mL量瓶中，加甲醇定容配制成1 000mg·L－1的标准储备液，4℃条件下保存。精密称取内标物顺铂对照品5mg，置于10mL量瓶中，加甲醇定容配制成500mg·L－1的顺铂储备液，4℃条件下保存。精密吸取储备液适量，用去离子水逐级稀释配制成质量浓度约为350μg·L－1的内标工作溶液。

2.3 血浆样品的处理 在1.5mL离心管中分别加入400μL血浆样品、10mg·L－1顺铂乙腈溶液500μL，涡旋震荡混匀，以15 000r·min－1离心10min，取上清液，进样30μL进行分析。

2.4 基质效应 分别按2.3配制含培美曲赛二钠10，100和600μg·mL－1和奥沙利铂20，200，1 200μg·mL－1的低、中、高质量浓度血浆质控样品（QC）各5份，其峰面积作为基质效应中的分子。另用纯净水替代血浆，按上述处理后进样，其峰面积作为基质效应分母。

2.5 动物体内的药代动力学实验

2.5.1 给药及采血方法 采用自身对照随机交叉的实验方法，选择三制剂三周期的3×3拉丁方设计，即9只Beagle犬随机分成3组，每组3只。第一周期3组动物分别经静脉给予注射用培美曲赛二钠（A）、注射用奥沙利铂（B）、注射用培美曲赛二钠和注射用奥沙利铂（C）；第二周期实验3组动物分别给予B、C、A；第三周期实验3组动物分别给予C、A、B。周期间隔为10d，每一周期实验开始前，受试犬禁食过夜（禁食12h），自由饮水。分别于给药前及给药后各时间点采集犬一侧前肢静脉血3mL，置于肝素抗凝管中，5 000r·min－1离心15min，分离血浆，置于－70℃保存备用。采样时间点：每日晨8时给药，采血点为实验周期的初次（第1天）给药前及给药后0.15，0.3，0.45，0.8，1，1.2，1.5，2，3，4，6，10，18和24h，末次（第7天）给药前及给药后0.15，0.3，0.5，0.8，1，1.2，1.5，2，3，5，7，8，18，24，36和48h。

2.5.2 数据分析 所有实验数据均以x±s表示。药动学参数t1／2、CLint和MRT采用DAS3.2.1统计学程序分别进行药物间、个体间单因素方差分析，药物单用与合用组的AUC和Cmax采用90%可信区间进行检验以判别培美曲赛二钠与奥沙利铂联合用药是否存在药动学相互作用，tmax用配对Wilcoxon检验。分别对单剂量和多剂量的单用给药的药动学各参数与合用给药的药动学参数进行比较。

3 结果

3.1 实验动物血浆中培美曲赛二钠和奥沙利铂的LC－MS／MS方法学考察 以药物质量浓度为横坐标（X）、药物和内标的峰面积比值（Y）为纵坐标作线性回归，采用加权最小二乘法求得：培美曲赛二钠线性回归方程：Y＝0.025 4 X＋0.063（R2＝0.998 1），定量下限为7μg·L－1，RSD为0.27%；奥沙利铂标准曲线：Y＝6.98 X＋2.258（R2＝0.999 5），定量下限为80μg·L－1，RSD为0.89%。培美曲赛二钠、奥沙利铂分别在7～150μg·L－1和80～900μg·L－1范围内线性关系良好，培美曲赛二钠和奥沙利铂的日内与日间精密度良好，RSD均＜15%（n＝5）；培美曲赛二钠、奥沙利铂提取回收率分别为92.5%～98.3%和98.5%～99.6%；含药血浆室温放置12h、反复冻融3次，并在－70℃下放置7，14和30d稳定。培美曲赛二钠低、中、高质量浓度基质效应（ME）分别为105.6%，94.2%和82.3%；奥沙利铂低、中、高质量浓度ME为110.2%，97.3%和86.2%。

3.2 实验动物单次口服培美曲赛二钠和奥沙利铂药代动力学相互作用 采用t检验对药动学参数Cmax、AUC0～t等参数进行比较，tmax进行非参数检验（Wilcoxon符号秩法），以判别培美曲赛二钠和奥沙利铂联合用药是否存在药动学相互作用。统计学分析结果显示，药物单用组与合用组的tmax经非参数检验（Wilcoxon检验）结果P＞0.05，差异无统计学意义。Cmax、AUC0～t经对数转换后进行t检验，差异没有统计学意义（见表1），结果判断培美曲赛二钠和奥沙利铂联合用药不存在显著的药动学相互作用。给予Beagle犬培美曲赛二钠和奥沙利铂后的主要药动学参数和平均血药质量浓度－时间曲线分别见表2和图1。与药物单用相比，联合培美曲赛二钠和奥沙利铂后，药物间和个体间各主要药动学参数t1／2、CLint、MRT差异均无统计学意义（P＞0.05）；Cmax、AUC0～t在90%可信区间的生物等效性统计结果合格。

表1 单用培美曲塞二钠和奥沙利铂在Beagle犬体内的生物等效性和生物利用度Tab.1 The bioequivalence and bioavailability of pemetrexed disodium and oxaliplatin in dogs after administation of a single dose （n＝9）

表2 单用培美曲塞二钠和奥沙利铂在Beagle犬体内的药代动力学参数Tab.2 The pharmacokinetic parameters of pemetrexed disodium and oxaliplatin in dogs after administation of a single dose

图1 单用培美曲塞二钠（A）和奥沙利铂（B）在Beagle犬体内平均血浆质量浓度与给药后的时间曲线Fig.1 Mean plasma concentration vs time curves of pemetrexed disodium（A）and oxaliplatin（B）in Beagle dogs after administration of a single dose ±s，n＝9）

3.3 实验动物多剂量给予培美曲赛二钠和奥沙利铂药代动力学相互作用 采用t检验对药动学参数Cmax、AUC0～t等参数进行比较，tmax进行非参数检验（Wilcoxon符号秩法），以判别培美曲赛二钠和奥沙利铂联合用药是否存在药动学相互作用。统计学分析结果显示，药物单用组与合用组的tmax经非参数检验（Wilcoxon检验）结果P＞0.05，差异无统计学意义。Cmax、AUCss经对数转换后进行t检验，差异没有统计学意义（见表3），结果判断：培美曲赛二钠和奥沙利铂联合用药不存在显著的药动学相互作用。给予Beagle犬培美曲赛二钠和奥沙利铂后的主要药动学参数和平均血药质量浓度－时间曲线分别见表4和图2。与药物单用相比，联合培美曲赛二钠和奥沙利铂后，药物间和个体间各主要药动学参数t1／2、CLint、MRT差异均无统计学意义（P＞0.05）；Cmax、AUC0～t在90%可信区间的生物等效性统计结果合格。

表3 合用培美曲塞二钠和奥沙利铂在Beagle犬体内的生物等效性和生物利用度Tab.3 The bioequivalence and bioavailability of pemetrexed disodium and oxaliplatin in dogs after administation of multiple dose （±s，n＝9）

表3 合用培美曲塞二钠和奥沙利铂在Beagle犬体内的生物等效性和生物利用度Tab.3 The bioequivalence and bioavailability of pemetrexed disodium and oxaliplatin in dogs after administation of multiple dose （±s，n＝9）

项目培美曲塞二钠AUC0～t Cmax奥沙利铂AUC0～t Cmax等效区间 80%～125% 70%～143% 80%～125% 70%～143%可信区间 95.3%～103.5%92.3%～140.2%88.6%～115.2%84.5%～126.4%结论 合格 合格 合格 合格

表4 合用培美曲塞二钠和奥沙利铂在Beagle犬体内的的药代动力学参数Tab.4 The pharmacokinetic parameters of pemetrexed disodium and oxaliplatin in dogs after administation of multiple dose

图2 合用培美曲塞二钠（A）和奥沙利铂（B）在Beagle犬体内平均血浆质量浓度与给药后的时间曲线Fig.2 Mean plasma concentration vs time curves of pemetrexed disodium（A）and oxaliplatin（B）in Beagle dogs after administration of multiple dose ±s，n＝9）

4 讨论

药物联合使用即多药合用时，可能出现药效增强或不良反应减轻等现象；也可能出现药效减弱或不应有的不良反应，甚至可能发生较严重的药物合用毒性反应。因此，必须重视药物配伍使用后的相互作用问题，在研发药物和药物临床使用前期，就应该清楚该药物与其他药物合用时可能产生的药物相互作用，以避免临床用药的不安全性［13］。

本研究对培美曲赛二钠和奥沙利铂药动学相互作用进行了探讨，所用的测定方法专属性良好，精密度、准确度、提取回收率等符合测定要求。预处理方法根据已有文献和实验结果进行调整。对测定内标进行了考察，最终选择顺铂作为测定的内标。

研究结果显示，注射用培美曲赛二钠和奥沙利铂分别单独给药和联合给药后，注射用培美曲赛二钠和奥沙利铂在实验犬体内的主要药动学参数Cmax、AUC0－t和tmax经统计学分析，差异无统计学意义，这表明注射用培美曲赛二钠和奥沙利铂合用，2种药物在实验犬体内不存在显著的药动学相互作用，其合用的吸收速率、吸收程度及消除速率与单独给药基本一致，提示在注射用培美曲赛二钠和奥沙利铂药物中，2种成分对彼此在实验犬体内的吸收、分布和消除不产生显著影响。本实验研究了注射用培美曲赛二钠和奥沙利铂联合用药在实验犬体内的药动学相互作用，为临床合理用药提供了参考依据。

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Pharmacokinetic interaction of pemetrexed disodium and oxaliplatin in Beagle dogs

ZHENG Xin，LI Qian，YOU Haisheng，YU Jia（the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061，China）

Objective The purpose of this study is to investigate the pharmacokinetic interaction of pemetrexed disodium and oxaliplatin in healthy adult Beagle dogs following single and multiple oral dose administration.Methods Nine Beagle dogs were divided into pemetrexed disodium group，oxaliplatin group，pemetrexed disodium and oxaliplatin group.Blood samples were collected at intervals after each intervenous administration.Then the plasma concentration was determined by LC－MS／MS，and the pharmacokinetic parameters were calculated by DAS3.2.1statistical moment method.AUC and Cmaxwas calculated by using 90%confidence interval method of bioequivalence and bioavailability.Results Compared with the separate administration，the main pharmacokinetic parameters（t1／2，CLintand MRT）had no significant difference（P＞0.05）；The 90%confidence intervals for bioequivalence statistics of drugs alone and in combination group were qualified，and tmaxtest showed no significant difference（P＞0.05）.Conclusion Pemetrexed disodium and oxaliplatin have no pharmacokinetic interaction in Beagle dogs.

pemetrexed disodium；oxaliplatin；pharmacokinetic interactions

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.020

R945

A

1004－2407（2015）02－0169－04

2014－07－28）