六肽对犬血小板聚集功能的影响

龙丽辉，梁少丽，韩旭亮，刘 静，曹永孝＊（.西安医学院附属医院药剂科，西安 70077；.西安交通大学医学部药理学系，西安 7006）

六肽对犬血小板聚集功能的影响

龙丽辉1，梁少丽1，韩旭亮1，刘 静2，曹永孝2＊（1.西安医学院附属医院药剂科，西安 710077；2.西安交通大学医学部药理学系，西安 710061）

目的 研究六肽对犬血小板聚集功能的影响。方法 采集犬股动脉血，以枸橼酸钠抗凝，用比浊法测犬血小板在不同诱导剂诱导时的聚集率。结果 1×10－6mol·L－1六肽，抑制由二磷酸腺苷、花生四烯酸和凝血酶诱导的犬血小板聚集的抑制率分别为88.47%±1.15%，97.68%±0.72%和32.02%±3.78%；六肽1×10－8～1×10－5mol·L－1组对由ADP诱导的血小板聚集率显著低于对照组（P＜0.01或P＜0.05），且各剂量对之间相应的血小板聚集率有显著差异（P＜0.01或P＜0.05）。六肽抑制犬由花生四烯酸、二磷酸腺苷和凝血酶诱导的血小板聚集的IC50分别为1.29×10－9，7.24×10－8和2.88×10－6mol·L－1；对于依替巴肽，同等条件下测得其IC50分别为6.76×10－10，5.74×10－8和1.62×10－6mol·L－1。结论 六肽在体外可以抑制犬血小板聚集，其作用效果类似于依替巴肽。

六肽；血小板聚集；二磷酸腺苷

血小板具有诸多功能，能够参与止血和血栓形成，血小板功能亢进是血栓性疾病的直接危险因素，因而血小板功能的研究在血栓形成的研究中日益处于重要地位。有研究证实，六肽血栓靶向微泡对犬股静脉血栓超声回声强度明显增强，比基线和非靶向微泡回声强度明显增强［1］；六肽血栓靶向微泡联合低频超声，动脉内给药或静脉给药，对缺血性脑卒中1h兔大脑中动脉脑血栓有显著的溶栓效果［2］。本文通过研究六肽对体外犬血小板聚集功能的影响，旨在探索六肽的抗血栓作用是否与其对血小板功能的影响有关，是否可以通过抑制血小板的聚集而抗血栓形成。

1 仪器与材料

1.1 仪器 五分类全自动血液分析仪（Sysmex SE－9000型，日本）；四通道血小板聚集仪（LBY－NJ4型，北京普利生仪器有限公司）；电子分析天平（AB 135－S型，瑞士梅特勒托利多公司）；台式离心机（TL－4型，湖南仪器仪表总厂）；旋涡混合器（上海精科实业有限公司）；超声波清洗机（CQ－120型，上海跃进医用光学器械厂）。

1.2 试药 六肽（代号P1Z4A5，北京生物制品研究所，批号090106）；氯吡格雷（济南乐康信药业有限公司，批号080301）；依替巴肽（苏州肽生产有限公司，批号2008010301）；双嘧达莫注射液（山西亚保药业集团股份有限公司，批号070801）；肾上腺素注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批号070412）；凝血酶（长春国奥药业有限公司，批号2081101）；阿司匹林（Sigma公司，货号A 2093－100G）；花生四烯酸（Sigma公司，货号A 9673－10MG）；ADP Na2（Sigma公司，货号为A2754－1G）；水为实验室双蒸水。

1.3 动物 健康家犬6只，雌雄兼用，体质量15～30kg，购自西安交通大学医学院实验动物中心，合格证号：陕医动证字第082004号，分笼饲养，自由饮水，喂颗粒饲料。

2 方法

2.1 药物溶液配制 取适量六肽置于EP管中，加反应量10g·L－1碳酸钠水溶液，摇匀，加0.009 g·L－1注射用生理盐水，超声15min，备用，临用前配成6×10－8～6×10－4mol·L－1的溶液。取适量依替巴肽，加0.009g·L－1注射用生理盐水，超声15 min，备用，临用前配成6×10－5mol·L－1的溶液。取阿司匹林适量，临用前，溶于碳酸钠（100mmol·L－1）水溶液中，以盐酸调节pH值至7.0［3］。二磷酸腺苷用生理盐水配制成3 000μmol·L－1的溶液，置于－20℃冰箱备用，临用前，以生理盐水稀释至所需浓度；花生四烯酸用无水乙醇配成0.1g·L－1溶液，临用前，再用碳酸钠溶液（0.1g·L－1）稀释至所需浓度［4］。

2.2 血小板聚集 犬用0.03g·L－1戊巴比妥钠溶液（40mg·kg－1）腹腔注射麻醉，采股动脉血，以枸橼酸钠（0.038g·L－1）∶全血为1∶9抗凝。血小板的制备：上下颠倒装有抗凝血的试管数次，以1 000 r·min－1离心10min，得到富血小板血浆（PRP）；吸取上清液，以3 000r·min－1离心10min，得到贫血小板血浆（PPP），若无溶血现象的血浆可用。以PPP调节PRP管血小板数，最终使PRP达到约250 nL－1。以上操作在室温下进行。

血小板聚集实验：依文献描述［5］，取含300μL血小板数250nL－1的血浆于样品方杯中，置于四通道血小板聚集仪的预热孔中，分别加生理盐水、六肽溶液（终浓度1×10－5～1×10－9mol·L－1）、依替巴肽溶液（终浓度1×10－6mol·L－1）、氯吡格雷溶液（终浓度3×10－5mol·L－1）、双嘧达莫溶液（终浓度2×10－6mol·L－1）和阿司匹林（终浓度2.8×10－4mol·L－1），于37℃培育20min后，以PRP调节各测试孔透光率为0%，以PPP调节各测试孔透光率为100%。各受试方杯分别加入ADP（终浓度50μmol·L－1）与肾上腺素（终浓度为2μmol·L－1）、花生四烯酸（终浓度1.0 mmol·L－1）或凝血酶（终浓度0.4U·mL－1）诱导血小板活化，同时加入磁子搅拌，计时，记录各样本5 min内血小板聚集曲线。按下式计算血小板聚集抑制率。血小板聚集抑制率（%）＝ （对照组血小板聚集率－受试组血小板聚集率）／对照组血小板聚集率×100%。

2.3 统计学处理 数据以x±s表示。采用SPSS13.0软件进行数据统计分析，用非配对t检验法检验组间和组内差异，以P＜0.05被认为差异有统计学意义。作图使用Graph Pad Prism 5.0软件。

3 结果

3.1 由ADP诱导的犬血小板聚集 采集犬抗凝血，进行六肽及4种阳性对照药对其血小板聚集率的测定。由表1可知，1×10－8mol·L－1～1×10－5mol·L－1六肽，使用ADP诱导的血小板聚集率分别为43.90%±3.72%，31.16%±3.16%，6.28%± 1.15%和3.30%±1.27%，显著低于对照组54.49% ±1.10%（P＜0.01或P＜0.05），且六肽不同剂量组之间的血小板聚集率有显著差异（P＜0.01或P＜0.05）。ADP受体拮抗剂氯吡格雷对血小板聚集抑制率为89.19%±0.56%。

表1 六肽对50μmol·L－1ADP诱导的犬血小板聚集的作用Tab.1 Effect of hexapeptide on dog platelet aggregation induced by 50μmol·L－1ADP （±s，n＝6）

表1 六肽对50μmol·L－1ADP诱导的犬血小板聚集的作用Tab.1 Effect of hexapeptide on dog platelet aggregation induced by 50μmol·L－1ADP （±s，n＝6）

注：与对照组比＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别 浓度／mol·L－1 聚集率／% 聚集抑制率／%对照组 －54.49±1.10 0六肽 1×10－5 3.30±1.27＊＊93.94±1.27＊＊六肽 1×10－6 6.28±1.15＊＊88.47±1.15＊＊六肽 1×10－7 31.16±3.16＊＊42.82±3.16＊＊六肽 1×10－8 43.90±3.72＊19.43±3.72＊六肽 1×10－9 47.02±5.63 13.71±5.63依替巴肽 1×10－6 4.28±1.61＊＊92.14±1.61＊＊氯吡格雷 3×10－5 5.89±0.56＊＊89.19±0.56＊＊双嘧达莫 2×10－5 47.42±4.98 12.97±4.98阿司匹林 2.8×10－5 31.87±2.43＊＊41.51±2.43＊＊

3.2 由AA诱导的犬血小板聚集 由表2可知，由花生四烯酸诱导的对照组犬血小板聚集率为46.57% ±3.83%，六肽各剂量组及4种阳性对照药对由AA诱导的血小板聚集率均显著低于对照组（P＜0.01）。AA通路拮抗剂阿司匹林的血小板聚集抑制率为98.78%±0.18%。结果表明，六肽可以显著抑制由AA诱导的犬血小板的聚集。

表2 六肽对1.0mmol·L－1AA诱导的犬血小板聚集的作用Tab.2 Effect of hexapeptide on dog platelet aggregation induced by 1.0mmol·L－1AA ±s，n＝6）

表2 六肽对1.0mmol·L－1AA诱导的犬血小板聚集的作用Tab.2 Effect of hexapeptide on dog platelet aggregation induced by 1.0mmol·L－1AA ±s，n＝6）

注：与对照组比＊＊P＜0.01。

组别 浓度／mol·L－1 聚集率／% 聚集抑制率／%对照组 － 46.57±3.82 0六肽 1×10－5 0.23±0.52＊＊99.51±0.52＊＊六肽 1×10－6 1.08±0.72＊＊97.68±0.72＊＊六肽 1×10－7 1.37±0.62＊＊97.06±0.62＊＊六肽 1×10－8 8.51±0.71＊＊81.72±0.71＊＊六肽 1×10－9 26.46±3.57＊＊43.18±3.57＊＊依替巴肽 1×10－6 0.45±0.24＊＊99.03±0.24＊＊氯吡格雷 3×10－5 9.97±0.96＊＊78.59±0.96＊＊双嘧达莫 2×10－5 11.66±2.40＊＊74.96±2.40＊＊阿司匹林2.8×10－5 0.57±0.18＊＊98.78±0.18＊＊

3.3 由凝血酶诱导的犬血小板聚集 由表3可知，由凝血酶诱导的对照组犬血小板聚集率为54.40% ±3.07%，1×10－7mol·L－1～1×10－5mol·L－1六肽对凝血酶诱导的犬血小板聚集率，与对照组相比，显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。

表3 六肽对0.4 U·mL－1凝血酶诱导的犬血小板聚集的作用Tab.3 Effect of hexapeptide on dog platelet aggregation induced by 0.4U·mL－1thrombin ±s，n＝6）

表3 六肽对0.4 U·mL－1凝血酶诱导的犬血小板聚集的作用Tab.3 Effect of hexapeptide on dog platelet aggregation induced by 0.4U·mL－1thrombin ±s，n＝6）

注：与对照组比＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别 浓度／mol·L－1 聚集率／% 聚集抑制率／%对照组 － 54.40±3.07 0六肽 1×10－5 19.38±1.73＊＊ 64.38±1.73＊＊六肽 1×10－6 36.98±3.78＊ 32.02±3.78＊六肽 1×10－7 38.57±4.69＊ 29.10±4.69＊六肽 1×10－8 38.94±5.73 28.42±5.73六肽 1×10－9 47.60±4.25 12.50±4.25依替巴肽 1×10－6 34.59±1.86＊＊ 36.42±1.86＊＊氯吡格雷 3×10－5 53.47±2.76 1.71±2.76双嘧达莫 2×10－5 46.85±5.00 13.88±5.00阿司匹林 2.8×10－512.94±2.95＊＊ 76.21±2.95＊＊

3.4 不同诱导剂诱导的犬血小板聚集的IC50由图1计算，可得六肽分别由AA、ADP和Thrombin诱导的犬血小板的IC50分别为1.29×10－9，7.24× 10－8和2.88×10－6mol·L－1，同等条件下测得依替巴肽对由AA、ADP和Thrombin诱导的犬血小板的IC50分别为6.76×10－10，5.74×10－8和1.62×10－6mol·L－1。结果提示，六肽对ADP、AA和凝血酶诱导的犬血小板聚集有抑制作用，且与依替巴肽对ADP和凝血酶诱导血小板聚集抑制效果相比，无数量级的差异。

图1 六肽抑制50μmol·L－1ADP，1.0mmol·L－1AA和0.4 U·mL－1凝血酶诱导的犬血小板聚集的浓度－效应曲线注：数据表示为x±s，n＝6。Fig.1 The concentration－response curves of hexapeptide inhibiting platelet aggregation induced by 50μmol·L－1ADP，1.0 mmol·L－1AA and 0.4U·mL－1thrombin in dogNote：Data were±s，n＝6

4 讨论

血小板被某种诱导剂诱导激活后，可释放包括加入的诱导剂之外的内源性诱导剂，加剧血小板聚集，因此，即使加入某一种诱导剂诱导血小板聚集，不仅作用于该通路的拮抗剂起效，作用于其他路径的拮抗剂也会由于血小板的释放作用而起到相应的抑制作用，即于相应通路抑制血小板聚集。本实验中所选用的血小板聚集诱导剂有ADP，其对应的拮抗剂选用了氯吡格雷［6－8］；当诱导剂为AA时，其对应通路的拮抗剂选用了阿司匹林［9－10］；当诱导剂为凝血酶时，其对应通路的拮抗剂选用了双嘧达莫［11］；当我们用AA作为诱导剂时，不仅阿司匹林具有显著的抑制血小板聚集作用，而且双嘧达莫和氯吡格雷都有显著抗聚集作用。

据文献报道，我们所采用的阳性对照药物依替巴肽（eptifibatide）［1215］，是化学合成的对GPⅡb／Ⅲa受体有特异识别作用的、含有KGD结构（赖氨酸－甘氨酸－天门冬氨酸，Lys－Glu－Asn）的环状七肽，该序列结构对糖蛋白受体有更高的亲和力和选择性。诱导剂虽有不同，但是能够作用于血小板聚集最终通路的GPⅡb／Ⅲa受体拮抗剂依替巴肽，产生了显著的抗血小板聚集作用。

六肽［16］，其化学结构式为H－Pro－Ser－Nva－Gly－Asp－Trp－OH，是在标准化氨基酸功能保护下，应用固相肽合成方法制备的，并用高效液相法、核磁共振法及质谱法进行定性定量分析，确定质量分数为98%的化合物。我们对其抗血栓形成机制进行研究时发现，该药分别在上述几种诱导剂诱导的血小板聚集过程中，均产生了显著的抑制作用，且与依替巴肽有相似的抑制曲线及基本一致的IC50。Scarborough等报道［17］，阿西单抗、替洛非班和依替巴肽的对犬血小板聚集的IC50分别为5，15和120nmol·L－1，替洛非班的IC50的数量级与我们所研究得到的六肽（7.24×10－8mol·L－1）及依替巴肽（5.74×10－8mol·L－1）的IC50数量级相同（均为ADP诱导）。由此我们可以得到的结论是：六肽和依替巴肽对由ADP诱导的犬血小板聚集的抑制作用基本相同。我们认为，六肽的抗血小板聚集的药效类似于依替巴肽，但其作用机制是否也类似于依替巴肽［18－19］，尚需要进一步研究。

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Influence of hexapeptide on platelet aggregation function in dog

LONG Lihui1，LIANG Shaoli1，HAN Xuliang1，LIU Jing2，CAO Yongxiao2＊（1.Department of Pharmacy，Affiliated Hospital of Xi′an Medical College，Xi′an 710077，China；2.Department of Pharmacology，Health Science Center，Xi′an Jiaotong University Xi′an 710061，China）

Objective This study was aimed to investigate the aggregation effect of hexapeptide on dog platelets.Methods Arteria cruralis blood of dog was sampled and anticoagulated with sodium citrate.The platelet aggregation rates induced by different inducers were determined with the method of turbidimetric test.Results The inhibition rates of dog platelet aggregation of 1×10－6mol·L－1hexapeptide induced by ADP，arachidonic acid and thrombin，were 88.47%±1.15%，97.68%±0.72%and 32.02%± 3.78%，respectively.The aggregation rates of dog platelet aggregation of 1×10－8to 1×10－5mol·L－1hexapeptide induced by ADP were significantly lower than that of control group（P＜0.01or P＜0.05），and the corresponding aggregation rates of each dosage groups had significant difference（P＜0.01or P＜0.05）.The anti－platelet aggregation IC50of hexapeptide induced by arachidonic acid，ADP and thrombin，were 1.29×10－9，7.24×10－8and 2.88×10－6mol·L－1，respectively.For eptifibatide，the anti－platelet aggregation IC50were 6.76×10－10，5.74×10－8and 1.62×10－6mol·L－1，respectively.Conclusion Hexapeptide can restrain dog platelet aggregation in vitro，and the effect is similar to eptifibatide.

hexapeptide；platelet aggregation；ADP

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.017

R965

A

1004－2407（2015）02－0158－04

2014－07－15）

陕西省科技厅社发攻关项目（编号：2012K14－04－01）；西安医学院附属医院项目（编号：XYFY11－02）

龙丽辉，女，副主任药师

＊通信作者：曹永孝，男，教授，博士研究生导师