核磁共振氢谱法（1H－NMR）测定西他沙星标准物质的含量

张芬芬，蒋孟虹，孙林林，毛黎顺，沈文斌（.中国药科大学药物分析教研室，南京 0009；.上海市食品药品检验所，上海 00；.江苏柯菲平医药科技有限责任公司，南京 006；4.中国药科大学药物科学研究院，南京 0009）

核磁共振氢谱法（1H－NMR）测定西他沙星标准物质的含量

张芬芬1，蒋孟虹2，孙林林1，毛黎顺3，沈文斌4＊（1.中国药科大学药物分析教研室，南京 210009；2.上海市食品药品检验所，上海 201203；3.江苏柯菲平医药科技有限责任公司，南京 210016；4.中国药科大学药物科学研究院，南京 210009）

目的 建立核磁共振氢谱法测定西他沙星标准物质的绝对含量。方法 采用Bruker AVANCE－500型和AVANCE－300型仪器，分别以盐酸吉西他滨和齐多夫定为内标，西他沙星中质子信号在δ8.69，δ7.76，δ3.43和δ3.14，盐酸吉西他滨质子信号在δ8.12，δ6.21和δ6.02，齐多夫定中质子信号在δ7.61和δ6.01作为定量峰，0.5mL DMSO－d6∶氚代盐酸（DCl，44.8 mg·L－1）＝4∶1为溶剂，测定条件为：探头温度303K，谱宽11.0，中心频率4.9，脉冲序列为zg 30°，延迟时间20s，采样次数32次，窗函数0.3Hz。结果 在此条件下，样品与内标盐酸吉西他滨及齐多夫定的定量峰分离良好，进样精密度及重复性较好，线性范围宽，样品与内标盐酸吉西他滨和齐多夫定质量比分别在0.354 9～1.343 9和0.312 4～1.189 2范围内，其线性拟合方程分别为：Y＝1.440 9X＋0.017 8（r＝1.000 0，n＝5），Y＝1.634 6X＋0.008 5（r＝0.999 9，n＝5）。结果西他沙星的含量分别为99.26%（RSD为0.06%）和99.22%（RSD为0.17%）。结论 该方法准确、专属、简便、快速，适用于该药物标准物质的绝对含量测定。

核磁共振氢谱法；西他沙星；含量测定

西他沙星（sitafloxacin，图1A）是由日本第一制药三共株式会社研制开发的一种新喹诺酮类广谱抗菌药［1］，其对大多数革兰阳性菌、阴性菌具强大的抗菌活性，对其他对喹诺酮类药物产生耐药性的厌氧菌和非典型致病菌如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌及链球菌也有抗菌活性［2］。2008年6月30日，西他沙星正式在日本上市片剂和细颗粒剂，被批准用于治疗呼吸系统及泌尿系统感染，其开发前景广阔。目前，《中国药典》2010年版、《美国药典》35版（USP35－NF30）、欧洲药典7.6版（EP 7.6）及日本药局方16版（JP 16）均未收载西他沙星的质量标准。作为创新药，目前报道较多的是西他沙星的药理作用［2－4］，其理化性质及检测方法也有报道［5－8］，如HPLC、LC／MS／MS及毛细管电泳法。HPLC测定方法准确、可靠，但需对照品才能完成定量测定［9－10］，LC／MS／MS及毛细管电泳法操作复杂。未见文献报道用核磁共振技术对其进行含量测定。

定量核磁共振法（quantitative nuclear magnetic resonance，QNMR）基于各化学环境中质子吸收峰的面积与诱发的核质子数呈正比，计算公式简单，不需特定的对照品，快速准确，特异性强及不破坏样品［1112］，特别适合无对照品的新药的含量测定。1HNMR检测灵敏度高，其定量准确度可达到或接近HPLC水平［13］，已应用于医药［14］、化学［15］、生物［16］、食品［17］、化工［18］、农业［19］以及军事［20］等诸领域，该方法现已被收载于《中国药典》2010年版［21］。本文建立了1H－NMR法，以盐酸吉西他滨（图1B）和齐多夫定（图1C）为内标，测定西他沙星的绝对含量。研究了溶剂、内标物、定量峰、核磁共振实验参数的选择对该方法结果的影响，为该标准物质的含量测定提供了一种新思路。

图1 化学结构（数字标记处为所选定量峰）A.西他沙星；B.盐酸吉西他滨；C.齐多夫定Fig.1 Chemical structure（marked signals were selected for quantitative analysis）A.sitafloxacin；B.gemcitabine hydrochloride；C.zidovudine

1 仪器与试药

1.1 仪器 Bruker AVANCE－500、AVANCE－300型超导核磁共振仪，采用QNP探头；AB265－S型电子天平（Mettler Toledo公司，感量0.01mg），真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 试药 西他沙星，由江苏柯菲平医药有限公司提供（批号101001）；齐多夫定（批号H0F263，质量分数99.0%，USP对照品）；盐酸吉西他滨（批号G0G083，质量分数99.7%，USP对照品）；氘代二甲亚砜（99.9%氘代，Sigma－Aldrich公司）；氘代盐酸（99.7%氘代，Sigma－Aldrich公司）；重水（99.9%氘代，Sigma－Aldrich公司）。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 分别精密称取供试品约10 mg，内标约6.5mg，置于同一离心管内，加DMSO－d60.4mL及DCl（44.8mg·L－1）0.1mL，振荡溶解，涡旋混匀，配制成每毫升分别含样品及内标0.04mmol的供试品溶液，转移至5mm标准核磁管内，即得。

2.21H－NMR测定条件 采用QNP探头，扫描宽度（sw）：11.0ppm，中心频率（O1P）：4.9ppm；脉冲序列：zg 30°；时间域数据点（td）：32K；测定温度：303 K；延迟时间（d1）：20s；采样次数（ns）：32次；窗函数（lb）：0.3Hz；每份样品平行测定5次。

2.3 西他沙星样品的测定 取干燥后的西他沙星样品，按2.1项下方法制备6份供试品溶液，按2.2项下条件进行测定，采集并处理图谱，并按下式计算样品含量。

其中：Ix和IIS分别为西他沙星和内标定量峰积分面积；Nx和NIS分别为西他沙星和内标定量峰积分信号包含的质子数（Nx＝4，NIS＝3（盐酸吉西他滨），NIS＝2（齐多夫定））；Mx和MIS分别为西他沙星和内标的相对分子质量；mx和mIS分别为西他沙星和内标的称样量；Px和PIS分别为西他沙星和内标的含量（%）。测定供试品的结果如表1和表2所示，以盐酸吉西他滨和齐多夫定为内标时，含量均值分别为99.26%和99.22%，RSD分别为0.06%和0.17%，结果较一致。

表1 内标为盐酸吉西他滨的西他沙星含量测定结果Tab.1 Results of gemcitabine hydrochloride for the determination of sitafloxacin

表2 内标为齐多夫定的西他沙星含量测定结果Tab.2 Results of zidovudine for the determination of sitafloxacin

2.4 专属性考察 西他沙星样品、内标及样品与内标混合溶液的核磁共振氢谱如图2所示。结果表明，样品氢谱中的质子信号δ8.69，δ7.76，δ3.43和δ3.14可作为定量峰，内标盐酸吉西他滨的定量峰可选δ8.12，δ6.21和δ6.02，齐多夫定的定量峰可选δ7.61和δ6.01，其混合溶液中样品与内标各定量峰能够完全分离，各定量信号无相互干扰。

2.5 线性及范围 精密称取约20，15，10，10和10 mg的西他沙星样品，分别置于离心管中，分别取内标盐酸吉西他滨与齐多夫定约7，7，7，10，13，6，6，6，9和12mg，精密称定，按2.1项下方法配制5份系列溶液，按2.2项下条件进行测定，以内标与西他沙星的摩尔比X为横坐标，以其定量峰积分面积比值Y为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：Y＝1.440 9 X＋0.017 8（r＝1.000 0，n＝5）；Y＝1.634 6 X＋0.008 5（r＝0.999 9，n＝5）。结果表明，样品与内标盐酸吉西他滨和齐多夫定质量比分别在0.354 9～1.343 9和0.312 4～1.189 2范围内，氢信号与样品称样量成正比，所建立以盐酸吉西他滨和齐多夫定为内标的西他沙星核磁共振定量法线性关系良好。

2.6 进样精密度实验 取供试品溶液，按2.2项下条件连续测定6次，记录积分面积，计算样品与内标盐酸吉西他滨和齐多夫定的积分面积比值的RSD（n＝6）分别为0.20%和0.15%。

2.7 重复性实验 取相同质量浓度的西他沙星样品适量，共6份，精密称定，按2.1项下方法制备供试品溶液，按2.2项下条件分别在500和300MHz仪器上进行测定。结果表明，以盐酸吉西他滨和齐多夫定为内标（n＝6）时，其含量测定值的RSD分别为0.13%和0.05%。

2.8 稳定性实验 取同一供试品溶液分别在0，10，12和16h进样测定，结果西他沙星与内标盐酸吉西他滨和齐多夫定的峰面积比值的RSD（n＝4）分别为0.05%和0.04%。表明供试品溶液室温放置16h稳定。2.9 耐用性实验 取同一供试品溶液，分别在298，303和308K温度下各连续测定5次。西他沙星与内标定量峰积分面积比值的RSD均为0.06%，说明在298～308K范围内，不同温度对样品的含量测定结果基本无影响。

3 讨论

3.1 溶剂的选择 理想的溶剂应该对待测样品有较好的溶解性、不与样品相互作用且黏度小。西他沙星在磷酸中微溶，在0.1mol·L－1盐酸、乙腈、甲醇中略溶，在无水乙醇中极微溶解，在水中几乎不溶，根据溶解性及所选内标在二甲亚砜中较易溶解的性质，考虑用DMSO－d6作溶剂。但在实际操作过程中发现，西他沙星在DMSO－d6中溶解性较差，且活泼质子信号干扰所选定量峰，可加入重水以消其干扰，但溶解性仍未改善。根据样品在0.1mol·L－1盐酸中略溶的特性，考虑加入适量的DCl为溶剂。通过考查比较加入不同比例DCl后样品的溶解性，最终确定测定溶剂为DMSO－d6∶DCl（44.8mg·L－1）＝4∶1，在此溶剂配比下，内标稳定，溶解性好，满足定量要求。

图2 1H－NMR图a.西他沙星和盐酸吉西他滨的混合溶液；b.西他沙星和齐多夫定的混合溶液；c.盐酸吉西他滨；d.齐多夫定；e.西他沙星Fig.2 1H－NMR spectraa.mixed solution of sitafloxacin and gemcitabine hydrochloride；b.mixed solution of sitafloxacin and zidovudine；c.gemcitabine hydrochloride；d.zidovudine；e.sitafloxacin

3.2 内标的选择 理想的内标应满足以下条件：定量峰与样品峰分离，溶于测试溶剂，不与待测样品相互作用等。根据西他沙星的氢谱可选择在低场区（5.5～7.7和8～8.5）出现信号的物质作内标。据以上条件，分别测定齐多夫定、盐酸吉西他滨的氢谱。结果表明，盐酸吉西他滨（δ8.12，d；δ6.21，d；δ6.02，dd）、齐多夫定（δ7.61，d；δ6.01，t）在化学位移值5.5～7.7和8～8.5的信号峰形简单，与样品无重叠，且盐酸吉西他滨和齐多夫定相对分子质量较大，与西他沙星相对分子质量之比约为1∶2，所选信号均各含1个质子，作为内标称样量与样品称样量近似，可减少称量误差，溶解性好，因此，选择盐酸吉西他滨和齐多夫定作为内标。

3.3 定量峰的选择 所选择的定量峰应该尖锐、孤立，性质稳定，若化合物中多个信号峰均符合条件，最好全部采用，取其平均值，以减小误差。根据西他沙星氢谱可知，其在化学位移3～9范围内，有4个峰（δ8.69，δ7.76，δ3.43和δ3.14）相对独立，与盐酸吉西他滨内标峰（δ8.12，δ6.21和δ6.02）及齐多夫定内标峰（δ7.61和δ6.01）均无重合。因此，选定δ8.69（1H，d），δ7.76（1H，d），δ3.43（1H，d）和δ3.14（1H，d）为西他沙星定量峰，δ8.12（1H，d），δ6.21（1H，d）和δ6.02（1H，dd）为内标盐酸吉西他滨的定量峰，δ7.61（1H，d）和δ6.01（1H，t）为内标齐多夫定的定量峰。

3.4 实验参数的选择

3.4.1 延迟时间（d1）的选择 脉冲延迟时间（d1）是定量实验中非常重要的参数，要确保其足够长（≥5 ×T1）［14］，以使原子核完全弛豫，从而使被积分的信号强度与原子核数目成正比。实验表明，当d1≥10s后，样品定量峰积分面积不再变化。为满足此条件且缩短实验时间，选择d1为20s。

3.4.2 采样次数（ns）的选择 采样次数（ns）直接影响信号的信噪比，对于1H－NMR，一般要求信噪比（S／N）≥250［12］，采样次数越多信噪比越好，但检测时间也越长。实验表明，当ns≥16时，其信噪比已满足定量分析要求，通过综合考虑选择ns为32。

4 结论

对于西他沙星标准物质的含量测定，由于各国药典尚未收载质量标准且有关文献报道较少，故对其研究具有重要意义。本文首次采用1H－NMR法，以盐酸吉西他滨和齐多夫定为内标，DMSO－d6∶DCl（44.8 mg·L－1）＝4∶1为溶剂，直接称量法配制供试品溶液，在理想的实验条件下，选择δ8.69（1H，d），δ7.76（1H，d），δ3.43（1H，d）和δ3.14（1H，d）为西他沙星定量峰，δ8.12（1H，d），δ6.21（1H，d）和δ6.02（1H，dd）为内标盐酸吉西他滨的定量峰，δ7.61（1H，d）和δ6.01（1H，t）为内标齐多夫定的定量峰，测得西他沙星含量分别为99.26%（RSD为0.06%）和99.22%（RSD为0.17%）。所建立的方法操作简便、快速准确、特异性强、不破坏样品、绿色环保，为西他沙星研发过程中标准物质含量测定提供了一种新的方法，为其质量控制研究提供实验依据。因此，QNMR法可作为该创新药物绝对含量的测定方法之一，也适用于其他新药的含量测定。

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Quantitative determination of sitafloxacin hydrate by proton nuclear magnetic resonance（1H－NMR）

ZHANG Fenfen1，JIANG Menghong2，SUN Linlin1，MAO Lishun3，SHEN Wenbin4＊（1.Department of Pharmaceutical Analysis，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China；2.Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China；3.Jiangsu Carefree Medicinal Limited Company，Nanjing 210016，China；4.Pharmaceutical Research Institute，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

Abstract：Objective To establish a novel method to determine the absolute content of sitafloxacin hydrate by1H－nuclear magnetic resonance（1H－NMR）.Methods The ideal spectra were obtained by Bruker AVANCE－500and AVANCE－300in 0.5mL solutions of DMSO－d6∶hydrochloric acid－d（DCl，44.8mg·L－1）＝4∶1，with gemcitabine hydrochloride and zidovudine as internal standards（IS），signals atδ8.69，δ7.76，δ3.43andδ3.14of sitafloxacin，δ8.12，δ6.21andδ6.02of gemcitabine hydrochloride and δ7.61andδ6.01of zidovudine were selected for quantitative analysis with detection conditions as follows：the probe temperature was 303Kand spectrum width（SW）was 11.0with center frequency（O1P）at 4.9，the pulse sequence was zg 30°，delay time（d1）was 20s，number of scans（ns）was 32，and line broadening（lb）was 0.3Hz.Results The sample and internal standards i.e.gemcitabine hydrochloride and zidovudine showed good separation，high precision and repeatability.The linearity ranges with equations，Y＝1.440 9 X＋0.017 8（r＝1.000 0，n＝5）and Y＝1.634 6 X＋0.008 5（r＝0.999 9，n＝5）were in the mass ratio range of 0.354 9－1.343 9and 0.312 4－1.189 2.The contents of sitafloxacin hydrate were 99.26%（RSD＝0.06%）and 99.22%（RSD＝0.17%），respectively.Conclusion This method was accurate，specific，simple，and rapid and can be used for the quantitative determination of the absolute content of sitafloxacin hydrate.

proton nuclear magnetic resonance（1H－NMR）；sitafloxacin hydrate；determination

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.010

R927.2

A

1004－2407（2015）02－0137－05

2014－09－10）

张芬芬，女，在读硕士研究生

＊通信作者：沈文斌，男，副研究员