罗汉果甜苷含药血清干扰肝星状细胞周期、凋亡的实验研究

龙 颖， 王 巍， 田 慧， 肖喜泉， 王 勤， 唐慧勤*

（1.广西中医药大学广西中药药效研究重点实验室，广西南宁530001；2.桂林市中医医院药剂科，广西桂林541002）

罗汉果甜苷含药血清干扰肝星状细胞周期、凋亡的实验研究

龙 颖1，2， 王 巍1， 田 慧1， 肖喜泉1， 王 勤1， 唐慧勤1*

（1.广西中医药大学广西中药药效研究重点实验室，广西南宁530001；2.桂林市中医医院药剂科，广西桂林541002）

目的研究罗汉果甜苷含药血清 （SCM）对大鼠肝星状细胞 （HSC-T6）合成的细胞外基质、细胞周期及凋亡的影响。方法体外培养HSC-T6细胞，并以SCM干预，然后测定细胞上清液中Hyp、透明质酸 （HA）和层黏蛋白（LN），同时检测细胞周期分布及细胞凋亡的变化。结果SCM（5%、10%和20%）细胞上清液中羟脯氨酸 （Hyp）水平显著降低；SCM（20%、10%）细胞上清液中HA和LN水平减少；SCM各质量浓度组作用48 h后，HSC-T6细胞周期产生明显变化，出现凋亡现象，且正常细胞比例呈剂量依赖性下降。结论罗汉果甜苷对HSC-T6细胞周期具有阻滞作用，能诱导其发生凋亡，并可抑制胶原生成，促进细胞外基质降解，可能是其抗肝纤维化的部分作用机制。

罗汉果甜苷；肝星状细胞；凋亡；细胞周期；细胞外基质；肝纤维化

肝纤维化的发生机制十分复杂，但主要是由于肝细胞外基质的过度增生和降解减少造成，而肝星状细胞是合成肝细胞外基质的主要细胞，在肝纤维化的发生发展过程中起着非常重要的作用［1-3］。罗汉果Siraitia grosvenorii（Swingle.）C. Jeffrey ex A.M.Lu et Z.Y.Zhang是药食两用的广西省特产中药，而罗汉果甜苷是其主要成分，对大鼠和小鼠的急慢性肝损伤均有保护作用，其机制可能是通过抑制肝星状细胞HSC-T6增殖及肝纤维化相关基因［4-8］。本实验研究了罗汉果甜苷对肝星状细胞凋亡、细胞周期和细胞外基质的影响，为进一步阐明其抗纤维化作用机制提供依据。

1 材料

1.1 药物及主要试剂 罗汉果提取物 （桂林莱茵生物科技股份有限公司，批号090201，提取工艺是以超声波提取得到粗提物，再以膜分离纯化得到，质量分数≥80%）；秋水仙碱片（Colchicine，云南植物药业有限公司产品，批号100807）。DMEM培养液 （美国Gibico公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；Hyp检测试剂盒（南京建成科技有限公司）；HA、LN检测试剂盒 （北京北方生物技术研究所）；细胞凋亡检测试剂盒 （南京凯基生物科技发展有限公司）；细胞周期检测试剂盒 （上海碧云天生物技术有限公司）。

1.2 动物及细胞株 SPF级SD大鼠，体质量120～150 g（广西医科大学实验动物中心，动物合格证号SCXK［桂］2009-0002）。肝星状细胞系HSC-T6（为SV40转染SD大鼠HSC，其表型为活化的HSC。广西医科大学黄仁彬教授）提供。

1.3 仪器 SW-CJ-1F超净工作台（苏州净化设备有限公

司）；311型二氧化碳培养箱、Thermo Forma 725超低温冰箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；XD-101倒置显微镜（南京江南光电集团股份有限公司）；SS-325高压灭菌锅（日本Tomykogo公司）；5415R小型台式离心机、5810R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；DFM-96型多管放射免疫计数器 （合肥众成机电技术开发有限责任公司）；722可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；Epics-XLⅡ型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）。

2 方法

2.1 含药血清的制备 取大鼠42只，随机分为罗汉果甜苷组、秋水仙碱阳性对照组和空白对照组，每组14只。罗汉果甜苷组每日灌胃给药400 mg/kg［8］，阳性对照组每日灌胃秋水仙碱0.1 mg/kg，空白对照组每日灌胃生理盐水10 mL/kg，每天给药2次，连续给药7 d。末次给药后1 h各组大鼠腹主动脉取血，4 000 r/min离心15 m in，合并同组大鼠血清，56℃下灭活30 min，0.22μm微孔滤膜滤过除菌，-20℃冰箱保存。罗汉果甜苷组血清中加入对照组血清，分别以1∶0、1∶1、1∶3比例稀释，进行预实验，结果发现1∶3稀释的含药血清对HSC-T6细胞增殖有显著抑制作用。然后，以不影响细胞生长的最大血清体积分数（20%）为罗汉果甜苷含药血清最大给药剂量，设置含药血清体积分数5%、10%、20%这3个梯度，均加入对照组血清稀释至相应体积分数。HSC-T6细胞培养体系中各组大鼠血清终体积分数为20%。

2.2 消化法和RIA法检测HSC-T6的细胞外基质 将肝星状细胞系HSC-T6接种于24孔板 （密度1×105个/mL），培养12 h后，换成含20%空白大鼠血清的培养液，分别设置罗汉果甜苷含药血清5%、10%、20%组、秋水仙碱含药血清20%组和空白对照血清20% （正常大鼠血清体积与其和培养液总体积的百分比值）组，每组设4个复孔。继续培养48 h后，收集细胞上清液，消化法检测其中羟脯氨酸（Hyp）水平，RIA法检测细胞上清液中透明质酸（HA）和层黏蛋白 （LN）水平。

2.3 流式细胞仪检测细胞周期 将HSC-T6细胞接种于5个50 mL培养瓶中 （密度1×105个/mL），培养24 h后，换成含20%空白大鼠血清的培养液，分组与给药方法同“2.2”项。继续培养48 h后胰酶消化，离心沉淀细胞，转移至1.5mL离心管内，70%乙醇在4℃下固定12 h，碘化丙啶染色，37℃下避光温浴30 min，流式细胞仪在488 nm波长处检测红色荧光和光散射情况。每份标本约测定10 000个细胞，测定速率为每秒50～60个细胞，MultiCycle AV软件进行细胞周期分析，以计算各期细胞百分率。

2.4 Annex V-FITC和PI双染法检测细胞凋亡 将HSC-T6细胞接种于5个50 mL培养瓶中 （密度1×105个/mL），培养24 h后，换成含20%空白大鼠血清的培养液，分组与给药方法同 “2.2”项。继续培养48 h后胰酶消化，离心沉淀细胞，调整细胞密度为1×105个/mL，1×Binding Buffer悬浮，加入1μL Annexin V-FITC，混匀后再加入5 μLPI，避光室温下反应5min，流式细胞仪检测（Ex=488 nm，Em=530 nm）细胞凋亡情况，绿色荧光FITC通道检测Annexin V-FITC，红色荧光通道检测PI。每份标本测定10 000个细胞，测定速率为每秒50～60个细胞。

2.5 统计学分析 用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据均以x±s表示，组间比较采用t检验。

3 结果

3.1 罗汉果甜苷血清对HSC-T6细胞上清液中Hyp、HA和LN的影响 随着浓度增加，细胞上清液中Hyp含有量呈递减趋势，罗汉果甜苷血清各浓度组中Hyp含有量与空白对照（NS）组比较，有显著性差异 （P＜0.05或P＜0.01），见表1。

表1 罗汉果甜苷血清对HSC-T6细胞上清液中Hyp、HA和LN的影响(x±s,n=4)

3.2 罗汉果甜苷血清对HSC-T6细胞周期的影响 经5%、10%和20%罗汉果甜苷血清作用于肝星状细胞HSC-T6 48 h后，细胞周期分布开始有明显变化，G2/M期细胞数量减少。其中，罗汉果甜苷血清5%和10%组中的细胞主要被阻滞于G0/G1期及S期，而20%组中的细胞被大量阻滞于G0/G1期，与空白对照组比较，10%和20%组均有显著性差异 （P＜0.01）。由此可见，随着药物浓度的增大，细胞被阻滞于G0/G1期的现象越明显，而在低浓度下时，可将其阻滞于G0/G1及S期，见图1和表2。

图1 罗汉果甜苷血清对HSC-T6细胞周期的影响

表2 罗汉果甜苷血清对HSC-T6细胞周期的影响(x±s, n=5)

3.3 罗汉果甜苷血清对HSC-T6细胞凋亡的影响 HSC-T6中空白对照组的细胞大多分布于流式图的第三象限，即为正常活细胞。随着体积分数增高，HSC-T6凋亡率呈剂量依赖性增加，与空白对照组比较，均有显著性差异 （P＜0.01），表明罗汉果甜苷血清对HSC-T6有明显的促凋亡作用，见表3和图2。

表3 罗汉果甜苷血清对HSC-T6细胞周期的影响(x±s,n=5)

图2 罗汉果甜苷血清对HSC-T6细胞周期的影响

4 讨论

多数研究表明，间质细胞，尤其是肝星状细胞 （HSC）在肝纤维化的发生发展中起重要作用［9-10］，因此诱导活化的HSC凋亡是抗纤维化治疗的有效手段［2］。本实验利用流式细胞仪，以磷脂酰丝氨酸外翻分析法（annexin V/PI）来检测罗汉果甜苷血清作用48 h后对HSC-T6细胞凋亡的影响。结果发现，与空白对照组相比，各药物浓度组均存在显著性差异 （P＜0.01），并随着药物浓度上升，细胞凋亡数量也随之增加，显示一定的量效关系。由此证明，罗汉果甜苷可有效地促进HSC-T6凋亡，这可能是其抗肝纤维化机制之一。另外，还应用了流式细胞术对细胞周期进行分析，结果发现罗汉果甜苷血清作用48 h后对其产生影响。低剂量罗汉果甜苷血清可将细胞周期抑制在G0/G1期及S期，而随着药物浓度增大，G0/G1期细胞堆积程度越明显，与空白对照组比较，各浓度的罗汉果甜苷血清对细胞周期的影响均存在显著性差异 （P＜0.01）。同时，高浓度罗汉果甜苷血清作用于HSC-T6后，G0/G1期细胞比例增加了约25%，说明它可将细胞周期抑制在G0/G1期，其阻滞机制尚有待进一步研究。

细胞外基质主要由胶原 （如Hyp）、非胶原蛋白 （如LN）、蛋白多糖 （如HA）三类成分组成，在肝纤维化过程中，三者可参与肝血窦基底膜形成，致使肝窦毛细血管化。正常情况下，肝细胞可直接与肝血窦接触，但一旦肝窦毛细血管化，可妨碍肝细胞与血窦间营养物质的交换，引起肝细胞发生缺血、缺氧、变性坏死，导致其功能障碍。各种致病因子 （如肝炎病毒、化学物质等）都能激活肝组织中多种细胞因子生成，并可刺激肝星形细胞增殖及活化，使胶原合成增加［2］。在前期研究发现，罗汉果甜苷对CCl4所致的大鼠和小鼠急性肝损伤有保护作用，说明其可减少CCl4对肝星形细胞的刺激［6-7］，而本实验也证实它能降低HSC-T6细胞上清液中Hyp、HA、LN水平，对细胞外基质有显著抑制作用，体内和体外实验结果一致。另外，前期研究还发现，罗汉果甜苷血清对HSC-T6中Col-I、TGF-β1和TIMP-1 mRNA表达均有显著抑制作用［7］。由此推测，罗汉果甜苷可能是通过抑制HSC-T6中Col-I、TGF-β1和TIMP-1 mRNA表达来抑制胶原生成，促进细胞外基质降解，从而达到逆转肝纤维化的目的。

本实验结合前期研究成果表明，罗汉果甜苷在体内和体外均有抑制肝纤维化发生发展的作用，可能成为一种潜力很大的治疗肝纤维化药物。

［1］Wirkowska A，Paczek L.Liver fibrosis and cirrhosis-selected cytokines，growth factors and proteins.PartⅡ［J］.Przegl Lek，2011，68（4）：228-230.

［2］陈主初.病理生理学［M］.北京：人民卫生出版社，2005：331.

［3］孙妩弋，魏 伟.肝星状细胞信号转导机制及可能的抗肝纤维化药物作用新靶点［J］.中国药理学通报，2006，22（12）：1433-1438.

［4］王 勤，李爱媛，黄荣奇，等.罗汉果保肝活性部位的研究［J］.中药药理与临床，1998，14（6）：31-32.

［5］王 勤，李爱媛，李献萍，等.罗汉果的药理作用研究［J］.中国中药杂志，1999，24（7）：425-428.

［6］王 勤，肖 刚.罗汉果甜苷对大鼠慢性肝损伤保护作用的实验研究［J］.广西中医药，2007，3（5）：54-56.

［7］王 勤，肖 刚.罗汉果甜苷对小鼠实验性肝损伤保护作用的研究［J］.中国药房，2008，19（3）：163-165.

［8］王 勤，王 巍，龙 颖，等.罗汉果甜苷对肝星状细胞HSC-T6增殖及肝纤维化相关基因的影响［J］.中草药，2013，44（3）：331-334.

［9］孔德松，郑仕中，陆 茵，等.肝内肌成纤维细胞的来源及其在肝纤维化中作用的研究［J］.中国药理学通报，2011，27（3）：297-300.

［10］Tarrats N，Moles A，Morales A，et al.Critical role of tumor necrosis factor receptor1，butnot2，in hepatic stellate cell proliferation，extracellularmatrix remodeling，and liver fibrogenesis［J］.Hepatology，2011，54（1）：319-327.

R966.1

：B

：1001-1528（2015）07-1576-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.041

2014-10-12

国家自然科学基金项目 （81160518）；广西自然科学基金项目 （2012GXNSFBA053088）；广西教育厅科研课题项目（20120220054）

龙 颖 （1977—），女，硕士，主管中药师，从事医院药学工作。Tel：（0773）2821921，E-mail：286723679@qq.com

*通信作者：唐慧勤 （1979—），女，硕士，讲师，从事药理学和中药药理学研究。Tel：（0771）2279423，E-mail：478839447@qq.com