洋地黄双苷眼用凝胶对大鼠糖尿病视网膜病变中细胞因子及炎症介质的影响

李凤华， 刘春娜， 刘新宇， 宋斐然， 姚红月， 郑久明， 杨 菁

（1.辽宁医学院药理学教研室，辽宁锦州121001；2.辽宁医学院附属第一医院，辽宁 锦州121001；3.中国医科大学，辽宁沈阳110013）

洋地黄双苷眼用凝胶对大鼠糖尿病视网膜病变中细胞因子及炎症介质的影响

李凤华1，2， 刘春娜1*， 刘新宇2， 宋斐然3， 姚红月2， 郑久明1， 杨 菁1

（1.辽宁医学院药理学教研室，辽宁锦州121001；2.辽宁医学院附属第一医院，辽宁 锦州121001；3.中国医科大学，辽宁沈阳110013）

目的本研究在大鼠糖尿病的基础上制备视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）模型，观察洋地黄双苷眼用凝胶对DR的保护作用，并对其机制进行探讨。方法取100只SD大鼠，尾静脉注射链脲佐菌素 （STZ）100mg/kg，四氧嘧啶100 mg/kg，3 d后诱发糖尿病，3个月后造成视网膜病变模型。模型大鼠分为5组，用不同质量浓度的洋地黄双苷眼用凝胶（0.1、0.3、0.5 mg/mL，早、午、晚各点眼1次），ELISA法测定血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白介素-6（IL-6）的水平，另取视网膜进行铺片，观察DR血管病理变化。结果视网膜病变动物一般状态较差，血糖、尿糖均升高，体质量下降，模型组VEGF、bFGF、IL-6和TNF-α水平均增加，与空白组比较，均具有显著性差异 （P＜0.05）。给予不同质量浓度的洋地黄双苷眼用凝胶后，以上4个指标水平均降低，与模型组比较，均具有显著性差异 （P＜0.05）。另外，给药组视网膜微血管病变明显改善，白内障及失明率显著下降。结论洋地黄双苷眼用凝胶通过降低炎症介质 （IL-6和TNF-α）及细胞因子（VEGF和bFGF）水平，对DR具有治疗作用。

洋地黄苷；七叶亭苷；糖尿病视网膜病变；细胞因子；炎症因子；碱性成纤维细胞生长因子；血管内皮生长因子

目前，糖尿病（diabetesmellitus）的发病率逐年上升，在我国已有近9460万的糖尿病患者，而糖尿病最为常见和严重的微血管并发症是视网膜病变（diabetic retinopathy， DR），其发病率高达70%以上。视网膜病变的主要标志为新生血管生成，是糖尿病代谢紊乱和内分泌系统损害在微血管中的最主要表现［1-2］。尽管视网膜病变发病机制尚不明确，但研究表明其与视网膜缺氧及缺血关系密切，视网膜在缺氧情况下会释放出多种炎性细胞因子，可刺激新生血管形成。视网膜病变早期病理改变为毛细血管周细胞选择性丧失，形成微血管瘤，之后基底膜逐渐增厚，导致视网膜组织中的渗漏性、闭塞性和增殖性微血管病变及血管周围纤维组织增生，出现新生血管异常，引起玻璃体出血甚至视网膜剥离［3-4］，最终导致视网膜病变患者失明。

目前治疗视网膜病变的方法主要有中药、中西医结合、针灸及手术等，但疗效均不甚理想。少数报道表明，洋地黄双苷眼用凝胶作用平和，局部用药不良反应较少，具有免疫抑制、抗炎等多种药理作用［5］。洋地黄双苷眼用凝胶是洋地黄叶干提物及七叶亭苷组成的复方制剂，主要成分为洋地黄苷和七叶亭苷，这两种血管活性成分能明显改善视网膜的微循环血供，并选择性作用于脉络膜，还可通过加强抗氧化应激来增加其血流量［6-7］。为进一步阐明洋地黄双苷眼用凝胶的疗效，本实验对其进行了视网膜病变的药效学及机制研究，为临床治疗提供有效药物。

1 材料

1.1 实验动物 SD大鼠120只，体质量180～220 g，雌雄各半。动物合格证号SCXK（辽）2003-0007。

1.2 实验药品 洋地黄叶干提物 （主要成分为七叶亭苷，白色针状结晶，无气味，味苦，分子式 C15H16O9，分子质量340.28，纯度98%以上，辽宁医学院新药研究所）。低剂量洋地黄双苷眼用凝胶为每10 mL含洋地黄叶干提物0.5 mg，秦皮甲素1.0mg；中剂量为每10 mL含干提物1.5 mg，秦皮甲素3.0 mg；高剂量为每10 mL含干提物2.5 mg，秦皮甲素5.0mg；空白基质。

1.3 分组 将SD大鼠随机分为5组，分别为空白对照组、视网膜病变模型组、洋地黄双苷眼用凝胶低、中、高质量浓度药物实验组，每组20只糖尿病大鼠。

2 方法

2.1 大鼠糖尿病模型的造模方法［6］上述动物均先适应性饲养7 d，除空白对照大鼠外，其余各组动物尾静脉注射链脲佐菌素（streptozocin，STZ） （溶于新鲜配制的0.1 mol/L，pH 4.3的柠檬酸钠缓冲液中）和四氧嘧啶各100 mg/kg，连续给药3 d，用于诱发糖尿病。另取20只空白对照组大鼠，腹腔注射相同体积的柠檬酸钠缓冲液。3 d后检测大鼠的血糖及尿糖，以空腹血糖超过16.5 mmol/L，尿糖++++以上，尿量及饮水明显增多的受试大鼠为实验对象，每周检测其尿糖、血糖以及体质量变化。糖尿病大鼠成模12周后，排除死亡和血糖恢复者，取其中80只作为视网膜病变模型，按上述分组情况用空白基质、低、中、高课题洋地黄双苷眼用凝胶（0.1、0.3、0.5 mg/mL）点眼，每天早、午、晚各点眼1次，每次药物在眼内停留60 s以上，不溢出，连续给药4周。

2.2 指标测定

2.2.1 观察一般状态、给药局部及尿糖、血糖变化 视网膜病变造模前后及给药期间均不禁食，术后任其自由活动，给予充足的水分及食物，并观察动物的一般状态以及药物点眼局部症状，关注是否有出血或白内障等症状出现，并且每周进行眼底镜检查。排除死亡和血糖恢复者，各组大鼠在给药后4周均随机选取10只作为受试对象，代谢笼收集其当日尿量，进行尿量测定和尿常规检测。剩余10只实验动物用20%乌拉坦 （1 g/kg）麻醉后颈动脉插管，负压抽血管取血2 mL，用于大鼠血糖等指标测定。

2.2.2 VEGF、SDF及炎症介质等的测定［6］药物点眼后4周，上述动物用乌拉坦麻醉后迅速摘除眼球，切开眼前节，沿锯齿缘环形剪开，以视神经为中心取带有视网膜的眼球后部，加生理盐水0.9 mL制备10%组织匀浆，冷冻离心（3 500 r/min，15 min）后取上清液，酶联免疫吸附法（ELISA法）测定血管内皮生长因子 （VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）、白介素-6（IL-6）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平。

2.2.3 数据统计 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。所有数据以用x±s表示；率的比较用卡方检验；组间比较采用单因素方差分析及LSD-t检验；相关关系采用直线相关分析。P＜0.05认为差异有显著性意义，P＜0.01认为差异有非常显著性意义。

3 实验结果

3.1 大鼠一般状态 所有糖尿病模型大鼠成模2周后，开始出现多饮、多食、多尿等典型的视网膜病变症状，随着病程延长，其体质量增长开始减缓，甚至上下波动。与空白对照组大鼠相比，模型组及实验组明显消瘦，并伴有活动减少、行动迟缓、懒惰、无进攻性、易感染。每组糖尿病模型大鼠在造模后3个月及给药1个月期间均出现死亡现象，死亡率30%～40%，排除死亡和血糖恢复者，各组在给药后4周均随机选取10只作为受试对象。在模型组中，大部分视网膜病变大鼠开始出现肉眼可见的白内障，并随时间延长而逐渐加重，部分失明。进行眼底镜检查时发现，给予不同课题洋地黄双苷眼用凝胶的动物眼底出血及白内障等症状明显改善，未见失明，见表1。3.2 血糖、尿糖及体质量变化 正常对照大鼠的血糖在3～6 mmol/L之间，且尿糖均为阴性，而糖尿病大鼠成模后血糖均在16.5 mmol/L以上，明显高于正常大鼠（P＜0.01），同时它们24 h的尿量也多于正常大鼠，尿糖均大于+++，持续2周以上。给药后4周，糖尿病大鼠体质量明显低于空白对照组 （P＜0.01）。受试药物组与糖尿病视网膜模型组在血糖、尿糖等方面无显著性差异 （P＞0.05），见表2。

表1 洋地黄双苷眼用凝胶对糖尿病视网膜病变影响 [动物数 (%)]

表2 糖尿病模型大鼠血糖、尿糖及体质量的变化 (x±s,n=10)

3.3 对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜细胞因子及炎症介质的改变 ELISA法测定各组实验大鼠VEGF、bFGF、IL-6及TNF-α水平，发现不同剂量洋地黄双苷眼用凝胶均能明显降低糖尿病大鼠视网膜内VEGF、bFGF、IL-6及TNF-α的表达，与糖尿病模型组相比，具有显著性差异 （P＜0.01），见表3。

表3 洋地黄双苷眼凝胶对糖尿病视网膜病变大鼠VEGF,bFGF,IL-6和TNF-α的影响(x±s,n=10)

4 讨论

目前，我国糖尿病发病率世界第一，而视网膜病变是糖尿病最为常见和严重的微血管并发症，其发生机制与氧化应激、老龄化、炎性反应及新生血管化等有关［8-9］。当视网膜病变发生时，血管通透性增加，血-视网膜屏障受损，促进VEGF释放。VEGF是最强的血管生成因子和内皮细胞选择性促有丝分裂因子，而bFGF是活性很强的血管内皮细胞促增殖剂和血管生成因子，具有促进内皮细胞增殖和新生血管生成的作用，两者参与了多种生理和病理性新生血管形成过程。视网膜病变患者由于视网膜缺血缺氧，眼内VEGF、bFGF大量产生，与高亲和力受体结合而介导血管内皮细胞增殖，导致新生血管形成［10-11］。

洋地黄双苷眼用凝胶是洋地黄叶干提物及七叶亭苷组成的复方制剂，主要成分为洋地黄苷和七叶苷。研究发现［12］，七叶苷主要成分为秦皮甲素和秦皮乙素，对黄斑变性等多种眼底病变有保护及治疗作用，同时具有非特异性抗炎作用。洋地黄双苷可通过减少毛细血管阻力，缓解血管痉挛，维持脉络膜的舒缩功能并增加其血流，改善DR眼底微循环，促进缺血组织迅速恢复，防止视网膜色素细胞萎缩，从而保护视网膜，可用于眼底黄斑变性和视网膜相关疾病的治疗。洋地黄双苷的血管活性成份能改善视网膜的微循环，使受损的上皮色素细胞及视神经细胞的功能得到恢复［13-15］。另有研究表明［15-16］，洋地黄双苷可降低线粒体膜电位，抑制视网膜细胞凋亡，也可能是其治疗DR的机制。

本实验结果表明，洋地黄双苷眼用凝胶局部点眼时，对一般状态等无影响，但能明显改善视网膜病变大鼠的眼底病理改变，减少出血、白内障及失明的发病率，使视网膜微血管病变得到明显的保护或延缓。另外还进一步证明，DR大鼠眼组织中VEGF及bFGF表达增加，酶联免疫吸附法测定病变眼组织中VEGF及bFGF变化时发现，与空白对照组比较，两者明显增加，而且有显著性差异 （P＜0.01），提示它们不仅能介导血管内皮细胞增殖，导致新生血管形成，而且在DR早期病变过程中也发挥重要的作用。洋地黄双苷可通过降低bFGF表达，抑制纤维增生及毛细血管基底膜增厚，对大鼠视网膜病变具有一定防治作用。同时实验显示，洋地黄双苷眼用凝胶可能是通过抑制VEGF介导的血管内皮细胞病理性增殖，达到既改善视网膜的缺氧状态，又促进新生血管的消退，从而抑制视网膜病变的发生及发展。

另外，视网膜病变大鼠眼组织中由于血管通透性增高，多种炎性介质渗出及生成增多，可能会进一步加速视网膜病变的发生及发展。而给予洋地黄双苷眼用凝胶后，大鼠IL-6和TNF-α水平明显降低，具有显著性差异 （P＜0.01）。因此，它能降低糖尿病大鼠视网膜中炎性因子的表达，对治疗视网膜病变效果明显，推测可能是通过抑制炎症介质生成和VEGF及bFGF介导的血管内皮细胞增殖，从而发挥保护及治疗作用。

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李凤华 （1978—），女，硕士，主治医师，从事内分泌中药药理工作。

*通信作者：刘春娜（1977—），女，博士，副教授，研究方向为中药药理学。Tel：（0416）4673465，E-mail：springnanaliu@163.com