果蔬中食源性致病微生物的研究进展

钱程 马晨 汤永娇 李建国

摘 要 全球食源性疾病的发生呈增长态势，由果蔬中食源性致病微生物引发的疾病也在逐年增加。因此，各国对于果蔬中食源性致病微生物的检测也越来越重视。目前，食源性致病微生物的快速检测和相关的防控技术成为研究的热点，本文综述果蔬中常见大肠杆菌、李斯特菌和沙门氏菌的种类、特性、病症、检测方法及防控技术，为保障食品安全提供参考。

关键词 果蔬 ；食源性致病微生物 ；耐药性 ；检测方法 ；防控技术

分类号 TS207.4

在全球范围内，食源性疾病广泛地威胁公众安全。2000年6月，日本雪印乳业生产的牛奶感染金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），导致1.4万人在饮用后出现呕吐腹泻等中毒症状；2005～2006年间，北美地区发生4起沙门氏菌（Salmonella）感染事件，共累及北美21个州；2010年，Newell DG调查研究表明，欧盟每年有1.3亿人患食源性疾病[1]；2013年，Jane M. Van Doren等[2-3]调查表明，美国每年有近5千万人感染食源性疾病。其中由食源性致病菌引起的食源性疾病所占比例最大[4]。

在这些案例中，动物源性食物携带致病微生物引起疾病的情况占大多数。而由果蔬携带致病微生物引发疾病的现象也呈逐年增多的趋势。

2011年5月，德国北部某公司生产的豆芽中带有肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli），造成欧美等国68人死亡，数千人感病，导致西班牙农民平均每周损失2亿欧元；2013年10月，墨西哥产的新鲜香菜带有环孢子虫卵，导致美国爆发了大规模环孢子虫病，25个州共643人感染。

生食蔬菜，特别是绿叶蔬菜不仅可以传播致病菌，还可以传播病毒[5-7]；近几十年来，许多发达国家公众越来越注重健康的生活方式，对新鲜农产品的需求日益增长[8]；另外，果蔬被致病菌污染后，很难通过常规方法清洗掉[9]，这些都引起了各国对即食果蔬是否含有致病菌的高度重视。

中国在食源性致病微生物的监测方面存在很大漏洞。毛雪丹等[10]分析2003～2008年中国细菌性食源性疾病监测结果，推算出当时监测漏报率为99.992%。目前，中国对食源性致病微生物的检测重点主要集中在肉类食品和水产品中，沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157这些常见致病菌，对果蔬中的致病微生物研究较少[11-15]。

由于贸易全球化，食品在全球范围内流通，导致食源性致病菌的全球性传播[16]。中国生产出口的果蔬中常因含有致病菌，致使出口到发达国家的途径受阻。

由此可见，食源性致病微生物不仅威胁公众健康，也给贸易带来了挑战。我国需要进行深入的研究以应对未来可能存在的风险。因此，笔者主要对近年在果蔬中存在的主要人类致病菌种类及特性、当前致病微生物的检测技术和防控技术等3个方面的研究进行总结，了解当前的研究热点和寻找未来的研究趋势。

1 果蔬中主要人类致病菌种类及特性

1.1 主要致病菌种类

据美国CDC 2013年的报告显示，美国1998～2008年11年共计爆发食源性疾病事件273 120次，其中71%与食源性致病微生物相关。最常见的致病微生物为诺瓦克病毒（Noroviruses， NVs）、沙门氏菌、产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli， STEC）等，而导致住院率最高的则是产志贺氏毒素的大肠杆菌，致死率最高的是单增李斯特菌。沙门氏菌、产志贺毒素大肠杆菌以及单增李斯特菌（Listeria Monocytogenes）是造成美国每年多次爆发的主要病原物。而导致染病发病的相关食品分别为家禽（17%）、叶类蔬菜（13%）、牛肉（12%）、水果/坚果（11%），其中诺瓦克病毒常见于叶类蔬菜，水果和根茎类蔬菜上的沙门氏菌以及牛肉和叶菜类蔬菜上的大肠杆菌导致最高的染病住院率；家禽上携带的李斯特菌、水果上的沙门氏菌和叶菜类蔬菜上的大肠杆菌都具有最高的致死率[20-21]。

据《中国卫生部办公厅关于2012年全国食物中毒事件情况的通报》，全年共发生6 685起食品中毒事件，由微生物引起的中毒事件共计3 749起，占56.1%，死亡16人。微生物性食物中毒事件报道中，主要是由沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、大肠杆菌等引起的细菌性食物中毒。

由此可见，沙门氏菌和大肠杆菌引发的食源性疾病较为常见。然而由于中国与西方国家饮食习惯的差异，我国在果蔬上发生的食源性疾病所见不多而不够重视，从而导致致病微生物对即食果蔬的污染直接影响到我国农产品的对外出口，应引起足够重视。李斯特菌多见于禽肉类食品，但蔬菜也可作为其媒介进而导致人类发病[22-24]。值得注意的是，李斯特菌可在低温环境下存活以及其高致死率的特性，使得李斯特菌也备受关注[25]。

1.2 主要致病菌的特性

不同致病菌具有不同的特性，本文主要总结沙门氏菌、大肠杆菌和李斯特菌的临床表现以及耐药性。

1.2.1 主要致病菌的临床表现

主要致病菌的临床表现见表1[6]。

1.2.2 致病菌的耐药性

抗生素的滥用以及生态环境改变等影响，导致耐药性菌株（本文指耐抗生素）的出现[26]。世界各地相继发现报道耐药菌株。

20世纪90年代，已经发现一种非伤寒沙门氏菌出现耐药性[27]。21世纪初，鼠伤寒沙门氏菌被发现可以同时对5种抗生素（氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、磺胺类和四环素）产生抗性[28]，为有效防治沙门氏菌引起的疾病，氟喹诺酮类药物和头孢菌素类药物开始被使用[29]，但很快在一些样品中发现了对这2种抗生素有抗性的菌株[30]。2014年，有研究结果表明，在200份牛肉样品中发现100份样品存在耐药的沙门氏菌株，并且所有耐药菌株均对3种及以上的抗生素表现出耐药性[31]。

大肠杆菌更容易获得抗药性[32]，1988年就有耐药性的大肠杆菌（E. Coli. O157）报道，1996年又发现其他的大肠杆菌血清型（O111，O26）具有耐药性[33]。2010年，美国的一项研究表明，从不同年龄的健康乳牛肠道中分离到的大肠杆菌，大多数具有耐药性，并有15%表现出高抗性[34]。

1981年，第一例由李斯特菌引起的食源性疾病被报道[35]。1988年，第一例从一个脑膜炎患者体内分离得到的具有抗药性的单增李斯特菌被发现，李斯特菌能够抗氯霉素、红霉素、链霉素和四环素[36]，可以在短时间内进化出抗药的菌株，这与李斯特菌可以在低温、低pH值和高盐环境中的生长特性有关[37]。李斯特菌通常被认为不易获得抗性，但有研究者发现其抗性基因存在于移动质粒上，可以传播到其他的致病菌体内（包括李斯特菌、金黄色葡萄球菌等）[38]。近年来，对氟喹诺酮类药物和季胺类药物具有抗性的菌株被相继分离得到[39-41]。对工业消毒剂（如次氯酸盐等）产生抗性的李斯特菌也已经被发现[42]。

这些耐药性的菌株通常从动物粪便、动物体内和人体内分离得到，在植物中很少分离出耐药菌株。这与抗生素并不会直接喷洒在植物上有关，但在果蔬表面是否具有耐受其他有机物（农药、抑菌剂等）的菌株尚未见报道。应加强对此类致病菌的检测，防范潜在的风险。

耐药菌株的出现，给生产企业和医疗卫生机构带来了巨大挑战。致病菌对越来越多的抗生素产生抗性，应引起人们的重视和思考。未来，对于致病菌的防控不能仅仅依赖抗生素，需要寻找更多的方法综合防控致病菌，减缓其过快产生耐药性的菌株。

2 食源性致病菌检测技术

目前，实际用于食源性致病菌检测的方法主要有：分离培养、生化鉴定、酶联免疫吸附、聚合酶链式反应（PCR）以及环介导恒温扩增技术（LAMP）等。传统的检测方法耗时繁琐，灵敏度低的特点不能满足快速检测的需求[17-19]。

2.1 传统检测方法

传统的致病微生物检测鉴定的主要依据形态学特征、生理生化反应特征以及血清学反应。

2.1.1 形态学特征鉴定

主要方法：在显微镜下观察细胞外形大小、形状等，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置；在一定的固体培养基上生长的菌落特征，包括外形、大小、光泽等；在一定的斜面培养基上生长的菌落特征，包括生长程度、形状、颜色等；在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况；在液体培养基中生长情况，包括是否产生菌膜，均匀浑浊还是发生沉淀，有无气泡，培养基的颜色等进行鉴定。

2.1.2 生理生化反应特征鉴定

物质利用方面，对各种碳源（CO2、糖类等）、氮源（硝酸盐、铵盐等）、能源（光能、化学能等）和生长因子的要求进行鉴定；

利用生化试验，通过三塘铁琼脂试验、赖氨酸脱羧酶试验、靛基质试验、尿素琼脂试验、氰化钾试验等进行鉴定；

通过对氧气的要求，好氧、厌氧、兼性厌氧等进行鉴定。

2.1.3 血清学分型

很多细菌具有十分相似的表面结构或有作用相同的酶，在普通的技术（如电子显微镜）下仍无法判断。利用抗原与抗体的高度敏感特异性反应，可鉴别相似的菌种，或对同种微生物分型。

传统的微生物检验方法灵敏度高，费用低，能检测出食品中的微生物群落数量和特性等方面的定性和定量结果。然而传统检测方法费时费力，获得最终的结果通常需要数天时间，这增加了企业对于果蔬的储藏成本和质量控制成本，也加大了政府对于食品安全的监管难度。因此，需要快速的食源性致病微生物的检测方法。

2.2 快速检测方法

在食源性致病微生物检测领域所用快速检测方法有基于抗原—抗体相互作用的酶联免疫法、PCR（包括多重PCR、实时定量PCR等）等。还有研究者采用一些特殊材料的物理特性应用于致病微生物的检测。

2.2.1 酶联免疫法

酶联免疫法的基本原理是抗原与抗体的特异性结合。J. A Durant等[43]将小鼠单克隆抗体应用于酶联免疫法，该方法被证明可以用于定量分析混合菌群中的单一目标菌，这对于快速分析一个样品中是否含有致病菌具有借鉴意义。虽然酶联免疫法可以提高检测的速度（比传统方法快2～3 d），但酶联免疫法常出现假阴性结果，这可能与所用单克隆抗体的专一性有关，因此在试验过程中需要设置阳性和阴性对照试验。且还有所用的材料不能重复使用、不能分辨受损细胞、花费较贵等缺点。

2.2.2 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应的原理是根据碱基互补配对原则，在体外对目标菌的基因进行扩增。进而对基因测序，通过序列比对判断目标菌的种类。

聚合酶链式反应（PCR）具有更高的灵敏度，Si Hong Park等[44-46]研究称，对同一批样品的检测，PCR的灵敏度可达92%，而传统方法仅有50%。在聚合酶链式反应中，通过浓缩的步骤可以提高PCR法的灵敏度。但PCR需要进行繁琐的前处理步骤，且该方法不能区分活细胞和死细胞，很容易造成对样品的误判导致经济损失[47]。

但是，在运用传统方法之前采用PCR方法对样品进行快速检测，可以提高检测的方向性和目的性。

为提高PCR方法的效率，2000年，日本荣研化学株式会社开发了一种恒温的体外核酸扩增方法，即环介导恒温扩增技术（LAMP）。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件（63℃左右）保温30～60 min即可完成核酸扩增反应。由美国Diagenetix公司开发的Smart-DARTTM采用了该技术，省却了热循环仪，使得成本降低，并且根据其恒温扩增的特点大大提升了检测效率。Smart-DARTTM体积小巧，可以随身携带。它还采用Android系统控制仪器，使得数据传输和管理都更加简便。

2.2.3 其他检测方法

Jaya Sundaram等[48]用聚乙烯醇封装银纳米粒子用于致病微生物的检测，可以同时在一块基质上区别多种致病菌。Yigang Xu等[49]采用多重PCR与高效液相色谱相结合的方式同时分析多种致病菌的16S rRNA，但是同样无法区分活细胞和死细胞。

由于传统检测方法的弊端，新的快速检测方法在食源性安全领域广泛应用。然而，快速检测的方法并未被我国国家标准所采用，加之现行国家标准混乱的局面，增加检测人员的工作量，同时也影响了检测的效率。而在美国、欧盟等发达国家和地区，快速检测方法正在应用，这也凸显了我国食品安全领域与发达国家之间的差距。必须加速发展我国食品安全检测手段，才能适应经济的快速发展和缩短与发达国家的差距。

3 食源性致病微生物防控技术

在实际生产过程中，果蔬暴露在致病微生物的可能性存在于生产的每个环节，包括田间的栽培采收、工厂中的加工包装以及运输等过程。因此，致病微生物的防控需要对生产的每个过程进行防控，以确保果蔬最终的安全性。

在栽培过程中，受致病微生物污染的灌溉水是威胁果蔬质量的最重要因素[50-51]，然而，控制灌溉水的质量难度很大，因此目前的研究大多集中在评估灌溉水受污染的程度和灌溉水中致病微生物的检测监督。从灌溉水方面通过生物防治的方法防控致病微生物或许可以降低其危害程度。

在果蔬加工过程中，食源性致病菌通常会在加工材料的表面形成菌膜[52]，并具有高效的抗逆性。对于加工材料上致病菌的防控多采用杀菌剂等方法。目前，很多研究者通过提取天然产物中生物活性成分用于开发抗菌剂。Mélanie Turgis等[53]从月桂、肉桂、甘兰菊、百里香和香茅等植物中提取到的天然活性成分对大肠杆菌等7种致病菌具有不同程度的抗性。并且发现与乳酸链球菌素、片球菌素和2种从肠球菌中分离到的细菌素联合使用可增强抑菌效果，同时还可增加食物的感官效果。还有一些研究者通过在食物表面包覆一层具有抑菌效果的可食用膜，向其中混入天然活性成分，可以同时达到异菌和改善食物品质的效果。如Kyung W. Kim等[54]使用的壳聚糖涂层，Emrah Torlak等[55]发明的壳聚糖混合蜂胶的涂层，Mehdi Alboofetileh等[56]采用藻酸盐混合植物精油的纳米涂层等，都对常见的致病菌（如大肠杆菌、单增李斯特菌、沙门氏菌等）具有较好的抑菌效果。

在果蔬的运输过程中，导致致病微生物污染果蔬的情况多是由于工作人员的不规范操作、工作人员自身生病等原因携带致病微生物等情况造成。因此，在生产运输过程中，规范工作人员的操作、对患传染病的工作人员采取休假或加强防护等措施，可以有效防控致病微生物在运输过程中的传播。

对于已经受到致病微生物污染的果蔬，也有研究者采用一些方法来进行挽救，希望能在最大限度上挽回企业和个人的损失。Sung-Youn Kim等[57]通过震动的方法来减少生菜和菠菜表面的致病菌。在20 Hz的条件下震动20 s，可将蔬菜表面的大肠杆菌、单增李斯特菌和沙门氏菌分别减少776、5 370、177 CFU/g。并且证明该项技术适用于不同的蔬菜种类，但对于细菌对蔬菜表面的依附和脱离的机理尚待研究。Karine Trudeau等[58]发现使用γ射线辐照金黄色葡萄球菌24 h，可改变其表达的不同分子量蛋白的比例，这或许可应用于降低金黄色葡萄球菌的致病性。

Isabel Alegre等[59]发现假单胞菌CPA-7与沙门氏菌和单增李斯特菌有拮抗作用，可用于果蔬储运过程，避免其受到致病菌的污染。Wen-Hsuan Wu等[60]的研究表明，植物体本身可以产生一种氨基酸（IB-AMP1）用于抵御致病菌（包括金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和大肠杆菌O157）的侵染。而IB-AMP1与致病菌的亲和性要高于人细胞的亲和性。通过提高植物自身抵抗食源性致病菌的活性，可以极大提高果蔬类食品的安全性。还有研究者称低浓度的电解水可以作为有效的抑菌剂，抑制蔬菜、家禽和肉类中所含的致病菌[61]。

目前，通过物理方法和利用天然产物的方法被认为是安全可行的防控方法，因此也是防控研究的热点。通过提高果蔬本身的防御能力可以更好践行环保的原则。

在果蔬已经受到污染的既定事实后，对食源性致病微生物的防控实际上进一步增加了农产品的生产成本，造成一定的资源浪费。所以，从源头上按照良好的规范进行果蔬产品的生产、加工是既安全又经济的生产模式。

4 结语

从全球范围来看，食源性致病微生物带来的食品安全问题在发达国家已经成为威胁公众安全的最大安全隐患。在我国，食源性致病微生物所引发的安全问题也在逐年增加，政府和公众的关注也在不断改善。

由于食源性致病微生物导致我国果蔬在出口时屡屡受阻的事实也提醒我们，必须提升我国果蔬产品的质量，拓宽我国果蔬产品的销售渠道。

在我国，果蔬中常见的食源性致病微生物种类需要全面地调查，并向相关科研人员和公众公开，加强公众对其危害的防范意识。对于新发现的耐药菌株，需要尽量避免污染到果蔬产品以防引起大范围的传播。对致病菌耐药机理的研究可以为合理的防控致病微生物提供科学的数据支撑。

对食源性致病微生物的及时检测鉴定，是降低其引发危害的有力措施之一。传统和现代的检测鉴定方法分别具有不同的优势和不足，可以充分结合，取长补短，提高检测效率，及时通报致病微生物的污染情况，将危害程度降至最低。

对食源性致病微生物的有效防控，可以极大地降低其带来的危害。防控手段需要作用于果蔬生产的全过程，包括从田间生产到消费者食用。防控技术的研究除具有有效地控制致病微生物的效果外，还需要具有环境友好的特点。加强相关生产人员的防范意识，可以杜绝由于不规范的操作和管理造成的偶然污染，提高果蔬产品的品质。

鉴于许多国家已发生大规模食源性致病微生物的案例，我国需要建立相关监测网络，保证我国公民食用果蔬产品的安全性，确保我国出口果蔬产品的质量，提升我国农产品在国际市场上的贸易地位。

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