活血胶囊对气虚血瘀大鼠血浆中游离氨基酸的影响

马晓毅， 陈勇勇， 闫高颖， 王晓雯， 贾 璞， 王世祥， 刘勤社，， 郑晓晖*

(1. 西北大学生命科学学院，陕西 西安710069;2. 陕西省人民医院，陕西 西安710068)

活血胶囊是陕西省人民医院根据临床有效方剂研制而成，由黄芪、桃仁、红花、牛膝、酸枣仁、川芎、赤芍、枳壳、地黄、桔梗、当归、甘草等十二味中药组成，具有补气养血、活血化瘀、理气安神等功效，对治疗气虚血瘀所致动脉粥样硬化、心绞痛、颈椎病及腰椎盘突出、过敏性紫癜、神经衰弱等有显著疗效［1-4］。研究表明，气虚血瘀证与免疫反应异常和炎症发作有密切的关系［5］。氨基酸作为蛋白质的基本组成单位，与机体的免疫反应有重要相关性［6］。因此，本实验以气虚血瘀大鼠为模型，从血浆中氨基酸浓度变化的角度探讨活血胶囊治疗气虚血瘀证的机制，旨为其临床应用提供可靠的药理学依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1200 系列高效液相色谱仪(美国Agilent 公司);VER-TEX26 型快速混匀器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);超纯水机(重庆贝研科技发展有限公司);TGL-16G 高速离心机(上海浦东光学仪器厂);KQ 型数控超声波清洗器(苏州江东精密仪器有限公司)。

1.2 实验动物 SD 大鼠，SPF 级，雄性，体质量为200 ～230 g，购于西安交通大学医学实验动物中心，动物合格证号为SCXK (陕)-2007-001。

1.3 试剂与药品 活血胶囊(规格0.5 g/粒，批号20111207，西安大唐制药集团有限公司)，将活血胶囊内容物研磨成细粉，分别称取细粉5、10 和20 g，加入纯水研磨至50 mL，制备成10%、20%和40% 的水溶液;天冬氨酸 (Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸 (Gly)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和异亮氨酸(Ile)均购于Sigma 公司;邻苯二甲醛(批号20110119，天津市光复精品化工研究所);巯基乙醇(批号20110320，上海五联化工厂);四硼酸钠、氢氧化钠、无水乙酸钠和乙酸均购买于天津市恒兴化学试剂制造有限公司;乙腈为Fisher 公司生产;其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 混合氨基酸标准溶液配制 准确称量对照品Asp 3.27 mg、Glu 3.61 mg、Ser 2.58 mg、Gly 1.84 mg、Tyr 4.45 mg、Val 2.88 mg、Phe 4.05 mg、Trp 5.01 mg 和Ile 3.22 mg，用0.1 mol/L HCl 溶液在10 mL 量瓶中定容为2.45 μmol/mL 的混合氨基酸母液，并稀释成1 250.00、612.50、306.25、61.25、30.63、15.31 和7.66 nmol/mL 的系列混合标准溶液，4 ℃储存，备用。

2.2 氨基酸衍生化试剂配制 将13.40 mg 邻苯二甲醛溶于1 mL 无水乙醇中，加入20 μL 3-巯基乙醇，继而加入浓度为0.1 mol/L 四硼酸钠 (pH 9.6)溶液4 mL，摇匀，用0.45 μm 有机系微孔滤膜过滤，避光低温密封保存。为维持巯基强度，每天补充20 μL 巯基乙醇，可使用3 d［7］。

2.3 色谱条件 安捷伦TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为醋酸盐缓冲液 (20 mmol/L，pH 6.5)(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0 ～10 min，18% ～26% B;10 ～30 min，26% ～35%B)，柱温30 ℃;荧光检测激发波长Ex为340 nm;发射波长Em为455 nm;体积流量0.6 mL/min。

2.4 造模 选择健康SD 大鼠若干只，采用力竭游泳与饥饿法制作气虚血瘀模型。每天给予大鼠正常饮食量的1/3，将其放入水［深度(40 ±1)cm、温度(30 ±2)］℃中游泳，待其出现自然下沉时捞出，连续造模一个月。随后称取大鼠体质量，测定血流变学(全血黏度、血浆黏度、血细胞压积及血细胞聚集指数)指标，以确定造模成功［8-9］。

2.5 分组给药 选取10 只健康大鼠为正常对照组。选取造模成功的SD 大鼠40 只，随机平均分为气虚血瘀模型组、活血胶囊2、4 和8 g/kg 3 个剂量组，活血胶囊组每天灌胃给药，正常对照组和模型组灌服生理盐水，连续两周。

2.6 血浆样品采集与处理 大鼠给药结束后，禁食24 h，眼球取血0.3 mL 置于肝素化离心管中，离心10 min (9 000 r/min)，取上清液，冻存于-20 ℃。取血浆0.1 mL，加入4 倍量的乙腈沉淀蛋白，涡旋2 min，10 000 r/min 离心10 min，分离上清液，用0.45 μm 有机系微孔滤膜过滤。预处理好的样品40 μL 加入邻苯二甲醛衍生液100 μL轻轻混匀，室温静置2 min，进样10 μL。

2.7 统计学分析 统计学分析采用SPSS 16.0 统计学分析软件进行处理，采用单因素方差(oneway ANOVA )进行统计分析，计量结果全部采用±s 表示，以P ＜0.05 或P ＜0.01 为其差异显著性的标准。

3 结果

3.1 方法专属性 在上述拟定色谱条件下测定，混合氨基酸标准溶液及血浆样品色谱图见图1。由图可知，经过衍生的9 种氨基酸，35 min 内得到分离，并且不受血浆中其他内源性物质的干扰。

3.2 线性关系考察 分别精密吸取空白血浆100 μL 8 份，其中1 份加入20 μL 0.1 mol/L HCl 作为空白对照，其余7 份加入“2.1”项下系列氨基酸混合标准溶液20 μL，使终浓度为1.28、2.55、5.10、10.21、51.04、102.08 和208.33 nmol/mL。将8 份样品均按“2.6”项下的方法处理，测定空白血浆加标峰面积A1、空白血浆峰面积A2。以氨基酸对照品的峰面积Y =A1 -A2 为纵坐标，以氨基酸对照品浓度(nmol/mL)为横坐标(X)绘制标准曲线，得线性方程(见表1)。结果表明，各氨基酸对照品在1.28 ～208.33 nmol/mL 之间线性关系良好。1 ～9 号氨基酸的最低定量限(S/N =10 ∶1)分别为0.43、0.43、0.51、0.61、0.51、0.64、0.85、0.26、1.02 nmol/mL。

图1 氨基酸色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of amino acids

表1 9 种氨基酸的线性方程(n=6)Tab.1 Linear equations of nine kinds of amino acids(n=6)

3.3 血浆样品的检测结果 取“2.6”项下制备的血浆样品，在拟定的色谱条件下进样，测定血浆中9 种氨基酸的浓度，结果如表2 所示。

表2 活血胶囊对气虚血瘀大鼠血浆中9 种氨基酸的影响(±s，n=10)Tab.2 Effect of Huoxue Capsules on amino acids from plasma in rats with qi deficiency and blood stasis (±s，n=10)

注:与模型组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

对照组/模型组//nmol·mL-1名 称 (nmol·mL -1)(nmol·mL -1)活血胶囊组( )8 g/kg 4 g/kg 2 g/kg天冬氨酸 6.20 ±0.90＊＊ 3.93 ±0.51 6.13 ±0.81＊＊ 5.13 ±0.75＊＊4.25 ±0.56谷氨酸 31.25 ±4.00＊＊ 21.72 ±1.76 26.38 ±0.83* 26.10 ±0.98* 22.62 ±2.62丝氨酸 49.61 ±6.63＊＊ 100.49 ±5.07 58.50 ±3.17＊＊ 62.77 ±0.49＊＊ 72.76 ±2.32＊＊甘氨酸 79.33 ±3.27＊＊ 46.54 ±3.64 63.92 ±4.58* 50.98 ±4.45 49.12 ±1.54酪氨酸 90.23 ±0.65＊＊ 51.73 ±3.77 89.41 ±2.08* 57.27 ±5.89 50.37 ±7.14缬氨酸 31.33 ±1.02 19.58 ±0.16 21.05 ±3.09 17.06 ±2.37 16.87 ±2.18苯丙氨酸 5.27 ±0.79＊＊ 8.41 ±1.26 5.52 ±0.66＊＊ 5.69 ±0.85＊＊ 7.86 ±1.14色氨酸 21.51 ±2.00＊＊ 10.23 ±1.43 15.09 ±1.91＊＊ 11.40 ±1.39 10.37 ±1.31异亮氨酸 18.91 ±2.42＊＊ 5.42 ±0.75 12.26 ±0.03＊＊9.84 ±0.28 8.77 ±0.21

4 讨论

气虚而无力与邪抗争、无力驱邪外出，从而导致低度炎症持续发生与存在，所以气虚血瘀的本质是一种慢性炎症，需要通过调节免疫反应及抑制炎症来治疗气虚血瘀证［10-11］。氨基酸作为蛋白质的组成物质，与机体淋巴细胞的数量、免疫球蛋白的合成等密切相关［6，12-14］。研究表明，模型组与对照组相比，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸及异亮氨酸浓度降低，丝氨酸、苯丙氨酸浓度显著升高。从而验证了气虚血瘀证与血浆中氨基酸浓度的变化有着重要的相关性。与模型组相比，活血胶囊8 g/kg 可使天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸及异亮氨酸浓度显著升高，且趋于正常。剂量为4 g/kg 时，天冬氨酸、谷氨酸显著升高，但2 g/kg 剂量组，氨基酸浓度变化不大。由此可见，活血胶囊能够通过影响氨基酸的浓度提高机体免疫功能从而达到治疗气虚血瘀证的效果。

苯丙氨酸是酪氨酸和色氨酸的代谢产物，模型组与对照组比较，其浓度升高，而酪氨酸和色氨酸的浓度降低，可推测苯丙氨酸的代谢通路可能发生异常。模型组与对照组相比，丝氨酸浓度显著升高;活血胶囊组(2 ～8 g/kg)与模型组相比丝氨酸浓度均显著降低。由此可推测，活血胶囊对调节血浆中丝氨酸的浓度有重要的影响，但活血胶囊组对气虚血瘀证的丝氨酸代谢途径的影响仍需进一步研究。

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