加味当归补血汤通过调控TGF-β1 /Smad/ILK 的表达对阿霉素肾病大鼠足细胞的保护作用

杨彦裕， 陈 琳， 魏明刚 ， 程宗琦， 费 梅， 熊佩华， 缪丽燕

(1. 苏州大学附属第一医院，江苏苏州215006;2. 青海省人民医院，青海西宁810007;3. 苏州大学附属第一医院药学部，江苏 苏州215006)

流行病学研究表明慢性肾脏病的发病人群日益增多，在我国患者人数预计超过一亿人［1］，对于慢性肾脏病的防治耗费着大量的人力、物力，因此明确慢性肾脏病的病因病机和找出针对性的治疗方案是该疾病的核心工作。研究表明，导致肾脏病进展、出现慢性肾衰竭的根本原因是肾脏纤维化［2］。肾脏纤维化是一个复杂的过程，其中肾小球滤过膜的破坏是肾脏纤维化的重要进程［3］。研究表明足细胞是肾小球滤过膜的重要组成部分，足细胞的损伤和凋亡与肾脏纤维化直接相关［4］。因此，保护足细胞可以一定程度上延缓、修复慢性肾脏病进而延缓肾脏纤维化。Nephrin 和podocin 是足细胞上的重要功能蛋白，对Nephrin 和podocin 的表达的研究可以一定程度上帮助我们更加详细的了解足细胞的保护机制和延缓肾脏纤维化的过程，从而找到干预、控制乃至治疗肾脏纤维化的方法［5-6］。TGF-β1是纤维化相关的主要细胞因子，其表达上调与器官纤维化直接相关。研究发现TGF-β1具有通过TGFβ1/Smad 细胞信号通路调控下游的整合素连接激酶(integrin-linked kinase，ILK)的表达作用［7］。ILK是黏附因子家族重要的成员，ILK 与nephrin 和podocin 蛋白表达甚至足细胞功能之间有着密切关系［8-10］。因此，对于ILK 表达的调控可能是影响nephrin 和podocin 表达，进而影响足细胞功能的重要机制。这为我们通过调控细胞信号通路表达，从而达到延缓肾脏纤维化病变这一目的提供了理论基础。基于既往研究发现加味当归补血汤对于延缓大鼠肾脏纤维化、保护足细胞功能具有较理想的效果［4］。本实验探讨加味当归补血汤在阿霉素肾病大鼠模型中通过对TGF-β1/Smad/ILK 细胞信号通路调控，从而达到对于ILK 表达的影响，进而发挥对足细胞的保护作用。为加味当归补血汤对肾脏纤维化的治疗机制寻找更深层次的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性SD 大鼠32 只，体质量(200 ±20)g，SPF 级，由昭衍(苏州)新药研究中心有限公司提供，许可证号SCXK (苏)2013-0003。

1.1.2 试剂 一抗TGF-β1(批号ab64715)、Smad2/3 (批号ab63399)、ILK (批号ab52480)、GAPDH (批号ab9485)、nephrin (批号ab136894)，由美国Abcam 公司提供;二抗由上海基因公司提供。其他所有试剂均为国产，分析纯。

1.1.3 药物 黄芪(批号140506)、当归(批号140401)、川芎 (批号140325)和牛膝 (批号140504)，由苏州天灵药业有限公司提供，由我院制剂室按一定比例制成1 g/mL 混悬液;西药对照药为洛汀新(药物名为贝那普利，批号X2106)，由北京诺华制药有限公司提供。

1.2 方法 将32 只大鼠适应饲养1 周，普通饮食和自由进水，1 周后开始实验。根据随机数字表法随机分为空白组、模型组、洛汀新组、加味当归补血汤组。除空白组外，各组一次性尾静脉注射0.2%阿霉素溶液，每只按6 mg/kg 剂量，空白组注射等量生理盐水。第2 周应用尿蛋白试纸确定造模成功后开始灌胃。灌胃混悬液按照人常规剂量与大鼠用药的换算关系确定并按照1 mL/100 g 体质量计算使用量;空白组、模型组均按体质量灌1 mL/100 g 生理盐水。给药前使用代谢笼收集24 h小便并检测尿蛋白，此后每2 周测24 h 尿蛋白定量并在第8 周末将大鼠颈椎脱臼处死，快速剖取双肾，分别使用甲醛和液氮保存，然后进行病理及分子生物学检测。

2 观察项目及测定

2.1 24 h 尿蛋白定量 24 h 尿蛋白漏出的情况是反应肾脏损害程度的重要标志物，通过监测尿蛋白的改变，可以直观地了解阿霉素肾病大鼠肾脏的损害程度，从而了解治疗效果。

2.2 光学显微镜检测 将肾组织以10%甲醛固定后，脱水、浸蜡、石蜡包埋，切成2 μm 厚度的切片，每组8 张，进行HE 染色，观察肾小球的病理变化。

2.3 免疫组化实验方法

2.3.1 取材过程 同HE 染色相关步骤。

2.3.2 制备过程 组织固定与切片同HE 染色，切片后PBS 冲洗和抗原修复并封闭。滴加一抗室温静置1 h 后，4 ℃过夜。PBS 冲洗后滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温静置1 h。PBS 冲洗后滴加SP (链霉亲和素- 过氧化物酶)，室温放置30 min ～1 h。然后PBS 冲洗并DAB 显色5 ～10 min。常规脱水、透明、封片(用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上)、镜检，检测肾组织中TGF-β1、Smad2/3、ILK、nephrin 等的表达，每组8 张切片。每张切片随机观察8 ～10 个肾小球。棕黄色表达为阳性表达，应用病理图文分析软件进行分析。

2.4 采用RT-PCR 和Western blot 观察TGF-β1、ILK 和nephrin 的表达

2.4.1 RT-PCR 检 测 肾 组 织 内TGF-β1、ILK 和nephrin 表达 目的蛋白的引物序列是根据网上NCBI 数据库中各自基因序列设计获得，由上海康成生物技术有限公司合成。取各组大鼠肾皮质，采用异硫氰酸胍-酚-三氯甲烷一步法抽提总RNA，以分光光度法测RNA 含有量与纯度后，在-70 ℃环境中保存。取总RNA，运用逆转录试剂盒逆转录成cDNA。取PCR 产物加入溴酚蓝指示剂，进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像系统 (Alpha Imager 2000)对凝胶进行拍照、光密度数据分析，以GAPDH 作为内参照，结果分别与GAPDH 对照，数值以两者光密度比值表示。

2.4.2 Western blot 检测肾组织TGF-β1、ILK 和nephrin 蛋白表达 取各组大鼠肾皮质，用含蛋白酶抑制剂的组织裂解液在研磨器中研磨，离心取总蛋白。聚丙烯酞胺凝胶电泳后湿转仪湿转至硝酸纤维素膜。脱脂奶室温封闭60 min，加一抗于4 ℃过夜。然后加相应的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG，室温反应120 min，用ECL 化学发光剂在X 光片上曝光，显影、定影、冲洗晾干后扫描蛋白条带。以GAPDH 为内参，结果分别与GAPDH 对照，数值以两者光密度比值表示。

3 统计分析

4 结果

4.1 24 h 尿蛋白定量 各组大鼠尿蛋白定量有差异，为模型组＞洛汀新组＞加味当归补血汤组＞空白组，见表1 (P ＜0.05)。其中治疗组大鼠尿蛋白较模型组低，加味当归补血汤组尿蛋白低于洛汀新组，提示加味当归补血汤对于肾脏保护作用、降低尿蛋白的作用优于洛汀新。

表1 不同时间点各组蛋白尿定量检测情况(mg/24 h)(±s)Tab.1 Test result of proteinurias at different time in terms of groups (mg/24 h)(±s)

表1 不同时间点各组蛋白尿定量检测情况(mg/24 h)(±s)Tab.1 Test result of proteinurias at different time in terms of groups (mg/24 h)(±s)

注:与空白对照组比较，* P ＜0.05;与模型组比较，△P ＜0.05;与洛汀新组比较，▲P ＜0.05

组别 n 1 周 3 周 5 周 7 周空白对照组 8 10.12 ±3.36 14.56 ±5.15 12.11 ±3.88 13.85 ±3.1模型组 8 23.09 ±3.45* 58.65 ±17.26* 267.32 ±32.12* 323.21 ±41.39*洛汀新组 8 22.87 ±4.01* 49.41 ±17.19＊△ 181.16 ±30.26＊△ 136.54 ±42.01＊△加味当归补血汤组 8 21.77 ±4.14* 41.55 ±18.62＊△▲ 97.43 ±33.56＊△▲ 68.17 ±21.57＊△▲

4.2 肾组织病理学

4.2.1 HE 染色 见图1。空白组:系膜区无增生、基底膜无改变，肾小球、肾小管结构清晰可以分辨，无水肿、变性、坏死、萎缩等，肾小球内散在、偶见蛋白管型。模型组:系膜区增生、基底膜增生，系膜细胞、系膜基质增多，部分肾小管上皮细胞坏死脱落，官腔内可见透明管型，肾小球有蛋白管型。部分毛细血管可见瘀血，球囊壁增厚、黏连。洛汀新组:系膜区增生、毛细血管瘀血，部分肾小球形态改变，小球中可见蛋白管型。加味当归补血汤组:系膜区轻度增生、基质增多，偶见肾小管上皮细胞坏死脱落及少量蛋白管型。

图1 各组肾组织HE 染色(×400 倍)Fig.1 HE staining in each group of kidney tissues (×400)

4.2.2 免疫组织化学

4.2.2.1 治疗组在肾皮质对TGF-β1、Smad2/3、ILK 和nephrin 等的表达影响 模型组与空白对照组比较，TGF-β1、Smad2/3、ILK 的表达在肾皮质明显增加而nephrin 表达明显降低(P ＜0.05)。洛汀新和加味当归补血汤组与模型组相比，TGFβ1、Smad2/3、ILK 的水平明显降低，nephrin 水平增加(P ＜0.05)。治疗效果的组间比较，加味当归补血汤组比洛汀新组更明显 (P ＜0.05)(表2)。

表2 各组大鼠肾组织中TGF-β1、Smad2/3、ILK、nephrin 在肾皮质的表达情况(光密度积分)(±s)Tab.2 TGF-β1，Smad2/3，ILK and nephrin expressions in renal cortex in each group of renal tissues (integral optical density)(±s)

表2 各组大鼠肾组织中TGF-β1、Smad2/3、ILK、nephrin 在肾皮质的表达情况(光密度积分)(±s)Tab.2 TGF-β1，Smad2/3，ILK and nephrin expressions in renal cortex in each group of renal tissues (integral optical density)(±s)

注:与空白对照组比较，* P ＜0.05;与模型组比较，△P ＜0.05;与洛汀新组比较，▲P ＜0.05

组别 n TGF-β1 Smad2/3 ILK nephrin空白对照组 8 0.172 ±0.021 0.169 ±0.028 0.182 ±0.024 0.386±0.034模型组 8 0.433 ±0.023* 0.492 ±0.041* 0.415 ±0.032* 0.141 ±0.022*洛汀新组 8 0.361 ±0.018＊△ 0.329 ±0.031＊△ 0.333 ±0.021＊△ 0.252 ±0.021＊△加味当归补血汤组 8 0.296 ±0.019＊△▲ 0.277 ±0.022＊△▲ 0.229 ±0.023＊△▲ 0.287 ±0.018＊△▲

4.2.2.2 治疗组在肾组织对TGF-β1、Smad2/3、ILK 和nephrin 等表达的影响 应用免疫组织化学方法和病理图文系统半定量分析可以看出，模型组相比空白对照组的TGF-β1、Smad2/3、ILK 染色在肾组织明显加深而nephrin 染色降低。洛汀新和加味当归补血汤组与模型组相比，TGF-β1、Smad2/3、ILK 在肾组织上的染色水平降低的同时nephrin 水平增加。进一步分析显示，加味当归补血汤组优于洛汀新组，见图2 ～图5。

图2 各组肾组织TGF-β1 免疫组织化学染色(×400 倍)Fig.2 TGF-β1 immunohistochemical staining in each group of kidney tissues (×400)

图3 各组肾组织Smad2/3 免疫组织化学染色(×400 倍)Fig.3 Smad2/3 immunohistochemical staining in each group of kidney tissues (×400)

图4 各组肾组织ILK 免疫组织化学染色(×400 倍)Fig.4 ILK immunohistochemical staining in each group of kidney tissues (×400)

图5 各组肾组织nephrin 免疫组织化学染色(×400 倍)Fig.5 Nephrin immunohistochemical staining in each group of kidney tissues (×400)

4.3 血液相关的生化指标检测 各组大鼠血常规、肝功能和肾功能无明显异常，表明病变尚未达到肾功能衰竭的地步，且药物治疗对于大鼠无明显毒性(数据略)。

4.4 分子生物学检测 见表3 ～4，图6 ～7。应用NIH 的ImageJ 分析软件可以看出，模型组与空白对照组比较，肾皮质中TGF-β1和ILK 在蛋白和基因水平的表达上调，而nephrin 的表达水平明显下调(P ＜0.05)。洛汀新和加味当归补血汤组与模型组相比，在肾皮质中TGF-β1和ILK 在蛋白和基因水平的表达下调而nephrin 的表达水平明显上调(P ＜0.05)。进一步分析显示加味当归补血汤组优于洛汀新组(P ＜0.05)，这与免疫组织化学检测的变化趋势是一致的。

表3 各组大鼠肾组织中TGF-β1、ILK、nephrin mRNA 在肾皮质的表达情况(±s)Tab.3 TGF-β1，ILK and nephrin mRNA expressions in renal cortex in each group of renal tissues (±s)

表3 各组大鼠肾组织中TGF-β1、ILK、nephrin mRNA 在肾皮质的表达情况(±s)Tab.3 TGF-β1，ILK and nephrin mRNA expressions in renal cortex in each group of renal tissues (±s)

注:与空白对照组比较，* P ＜0.05;与模型组比较，△P ＜0.05;与洛汀新组比较，▲P ＜0.05

组别 n mRNA nephrin/GAPDH TGF-β1/ GAPDH ILK/GAPDH空白对照组0.365 ±0.015 0.161 ±0.016 0.157 ±0.018模型组 8 0.187 ±0.018* 0.385 ±0.018* 0.317 ±0.022*洛汀新组 8 0.252 ±0.019＊△ 0.313 ±0.019＊△ 0.325 ±0.014＊△加味当归补血汤组 8 0.295 ±0.021＊△▲ 0.228 ±0.017＊△▲ 0.234 ±0.016 8＊△▲

表4 各组大鼠肾组织中TGF-β1、ILK、nephrin 蛋白在肾皮质的表达情况(±s)Tab.4 TGF-β1，ILK and nephrin protein expressions in renal cortex in each group of renal tissues (±s)

表4 各组大鼠肾组织中TGF-β1、ILK、nephrin 蛋白在肾皮质的表达情况(±s)Tab.4 TGF-β1，ILK and nephrin protein expressions in renal cortex in each group of renal tissues (±s)

注:与空白对照组比较，* P ＜0.05;与模型组比较，△P ＜0.05;与洛汀新组比较，▲P ＜0.05

组别 n Protein nephrin/GAPDH TGF-β1/GAPDH ILK/GAPDH空白对照组0.386 ±0.025 0.212 ±0.019 0.267 ±0.033模型组 8 0.261 ±0.022* 0.437 ±0.022* 0.374 ±0.031*洛汀新组 8 0.284 ±0.023＊△ 0.372 ±0.029＊△ 0.335 ±0.030＊△加味当归补血汤组 8 0.306 ±0.028＊△▲ 0.304 ±0.026＊△▲ 0.298 ±0.033 8＊△▲

图6 各组大鼠肾组织中TGF-β1、ILK、nephrin mRNA 在肾皮质的表达情况Fig.6 TGF-β1，ILK and nephrin mRNA expressions in renal cortex in each group of kidney tissues

5 讨论

图7 各组大鼠肾组织中TGF-β1、ILK、nephrin 蛋白在肾皮质的表达情况Fig.7 TGF-β1，ILK and nephrin protein expressions in renal cortex in each group of kidney tissues

足细胞是肾小囊脏层的足样突起，借基膜与毛细血管内皮相连，相邻的足突通过功能蛋白如nephrin 和podocin 相嵌成栅栏状，突起间的裂孔孔隙宽约20 ～30 nm。其紧密的物理结构使其形成天然的物理屏障，阻止分子质量较大的蛋白滤过，保护着肾功能的正常运作;同时足细胞表面有一层糖蛋白，令其表面带有负电荷，可以选择性滤过一些大分子物质［11］，因此对于肾小球滤过功能而言，足细胞有着举足轻重的地位。进一步研究发现，足细胞通过细胞黏附分子与细胞外基质相连接，而其作用受到TGF-β1/Smad/ILK 信号通路的影响。TGF-β1/Smad/ILK 信号通路对于细胞外基质的聚集具有调控作用，同时还可以通过调控足细胞上的功能蛋白如nephrin 和podocin［8-10］影响肾小球的滤过。nephrin、podocin 作为足细胞上最重要的功能蛋白，构筑着足细胞的物理结构、维持其化学信号传递，是调控足细胞实现滤过功能的重要因子。故ILK 作为TGF-β1/Smad/ILK 信号通路最下游的信号因子，可以通过调控ECM、nephrin 和podocin 表达等方式影响足细胞的滤过功能，实现对于肾脏功能的影响。对于病变的肾脏而言，TGF-β1/Smad/ILK 信号通路通过逐级调控，导致处于最下游的ILK 高表达，破坏足细胞上的nephrin 和podocin 功能蛋白的表达［12］，改变足细胞的形态及功能，导致其足突融合和脱落;使细胞外基质的异常聚集，进而使大量蛋白漏出;导致肾脏病变加重，进而出现肾脏纤维化。因此足细胞的形态和功能改变与肾脏纤维化病变密切相关［4］。

阿霉素模型大鼠的转归是慢性肾脏病，蛋白尿是病变程度的重要标志物，表1 所示模型组大鼠蛋白尿明显高于其他各组，加味当归补血汤组、洛汀新组蛋白尿阳性，空白组蛋白尿阴性，提示阿霉素造模理想，经过药物干预后，可以一定程度上缓解蛋白尿水平，并且加味当归补血汤效果优于洛汀新。

结合图1 看出HE 染色中空白组肾小球结构优于模型组，经治疗干预的加味当归补血汤组、洛汀新组肾小球病变程度亦优于模型组，但较空白组差;表2 和图2 ～4 提示TGF-β1、Smad2/3、ILK等抗体:空白组各抗体轻度表达，模型组表达明显增强，加味当归补血汤组及洛汀新组一定程度表达，优于模型组，但较空白组差;表2 和图5 提示nephrin 蛋白在空白组上显著表达，在加味当归补血汤组、洛汀新组中部分表达，模型组中偶有表达。表3 和图6 ～7 提示，TGF-β1、ILK 和nephrin在基因和蛋白水平上表达情况与免疫组织化学测定出的结果之间有较好的一致性。进一步验证了加味当归补血汤可以通过TGF-β1/Smad/ILK 信号通路调控达到保护足细胞的作用。

从中医学的角度来看，慢性肾脏病导致肾脏纤维化的主要原因在中医辩证属于“肾络癥瘕”，其病机多为体虚夹瘀［13-14］，即脾肾两虚、血脉瘀阻。针对这一证型，制定了益肾健脾、活血通络的治疗原则。加味当归补血汤是在此基础上结合课题组多年的临床工作经验总结而来的方剂，其中，当归、川芎活血通络，是为君药，黄芪健脾益气，是为臣药，牛膝活血通络、引药入肾经为佐使药。该方剂在治疗慢性肾脏病中取得了较理想的疗效。在既往的实验研究中发现，加味当归补血汤具有降低尿蛋白和保护足细胞等作用。结合表1 ～2 和图1 ～7 所示，该方剂抑制TGF-β1和ILK 表达的同时提高nephrin 和podocin 的表达，从而达到保护足细胞和降低尿蛋白漏出的效果。因此我们认为加味当归补血汤对于慢性肾脏病治疗的机制，可能是通过调节TGF-β1/Smad/ILK 信号传导通路，进而上调nephrin 和podocin 蛋白的表达，以此达到保护足细胞和抑制肾脏纤维化的作用。

本实验证实干预TGF-β1/Smad/ILK 信号传导通路可以有效地保护足细胞，进而减轻、延缓肾脏纤维化进程。对于阿霉素模型大鼠而言，加味当归补血汤相对于血管紧张素转换酶抑制剂，在调控细胞信号通路、保护足细胞进而延缓肾脏纤维化等方面的效果更加显著。此项研究对于发掘传统中药和名方名药的研发提供了客观的实验依据。

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