真菌(1，3)-β-D-葡聚糖多克隆抗体制备及ELISA竞争法检测体系的建立

严俊，杨葳，翟栓柱，薛知信，郁彭，周泽奇

(1.天津科技大学生物工程学院，天津300457;2.天津市医疗器械技术审评中心，天津300070)

真菌(1，3)-β-D-葡聚糖多克隆抗体制备及ELISA竞争法检测体系的建立

严俊1，杨葳2，翟栓柱1，薛知信1，郁彭1，周泽奇1

(1.天津科技大学生物工程学院，天津300457;2.天津市医疗器械技术审评中心，天津300070)

目的建立高特异性和敏感性的(1，3)-β-D-葡聚糖酶联免疫吸附试验(ELISA)检测体系。方法经蛋白修饰的(1，3)-β-D-葡聚糖和真菌提取物作为免疫原制备兔多克隆抗体，并对高效价交叉反应弱的抗体进行纯化和辣根过氧化物酶(HRP)标记，最后建立真菌(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA竞争法检测体系。结果建立的ELISA竞争法检测体系线性范围为3.125～200 pg/mL。添加100、25和6.25 pg/mL抗原的血清回收率为97.8%～113.6%，重复试验的变异系数＜15%。该检测体系能有效地从血清样本中检出低浓度的烟曲霉、白念珠菌和高浓度的隐球菌，并且对结核分枝杆菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、克雷伯菌和金黄色葡萄球菌5种细菌抗干扰能力强。结论利用(1，3)-β-D-葡聚糖作为包被抗原，酶标抗体HRP-Ab3B作为检测抗体，成功建立了(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA竞争法检测体系。

(1，3)-β-D-葡聚糖;酶联免疫吸附试验;侵袭性真菌病

现代移植医学的发展、获得性免疫缺陷综合征等多种因素使低免疫人群增多，侵袭性真菌感染的发生率迅速增长。侵袭性真菌感染症状无特异性，诊断困难，有效治疗时间短，死亡率高。建立特异、快速、敏感的侵袭性真菌病检测方法是临床诊疗的需要。常用的鲎试剂检测(1，3)-β-D-葡聚糖的试验条件苛刻，假阳性因素过多(包括内毒素污染、溶血和部分抗肿瘤药物等)且不能检出隐球菌和毛霉菌等［1-3］。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)技术成熟，成本相对较低，诊断快速，便于临床实验室使用。因此，建立真菌(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA检测体系具有十分重要的临床应用价值。

材料和方法

一、材料

1.试验动物雄性新西兰兔(约2 kg/只)，由天津国际生物医药联合研究院提供和饲养。

2.抗原和菌种海带多糖、茯苓多糖、凝胶多糖、曲霉半乳甘露聚糖、念珠菌甘露聚糖和隐球菌荚膜多糖由丹娜(天津)生物科技有限公司提供，曲霉菌种由北京协和医院提供。

3.主要试剂牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)购自上海生工生物工程有限公司，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗兔IgG购自Abbkine公司，其它试剂购自Sigma公司。

4.主要仪器SPECTRAMAX 190酶标仪购自Molecular Devices公司，1260 Infinity高效液相色谱仪购自Agilent公司，ÄKTA蛋白纯化系统FPLC购自Amersham Biosciences公司。

二、方法

1.免疫原制备(1，3)-β-D-葡聚糖免疫原制备:使用过碘酸盐氧化法［4］和DMTMM试剂法［5］对(1，3)-β-D-葡聚糖(包括海带多糖、茯苓多糖和凝胶多糖等)进行BSA修饰。烟曲霉菌体和孢子免疫原制备:烟曲霉经液体30℃200 r/min摇床振荡培养48 h后过滤收集菌体［6］。用3.7%甲醛灭活，生理盐水洗涤。倒入液氮研磨破碎，收集上清液。烟曲霉经30℃平皿固体培养72 h后洗脱收集孢子。用3.7%甲醛灭活，生理盐水洗涤。用血球板法计数，超声波破碎，获得孢子破碎液。

2.动物免疫将免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化后对新西兰兔进行皮下多点注射。再次免疫改用弗氏不完全佐剂。第3次免疫后，每隔1周进行耳动脉采血，测定抗血清效价。当免疫后效价不再升高时，颈动脉放血，分离抗血清。

3.间接法测定效价用磷酸盐缓冲液稀释抗原作为包被液，在4℃包被过夜后弃去，洗液洗涤3次，封闭液封闭。用磷酸盐缓冲液梯度稀释抗血清/多克隆抗体后加到酶标板上，37℃孵育1 h，洗板后加入HRP标记的羊抗兔IgG工作液，37℃孵育30 min，洗板后加入四甲基联苯胺底物，37℃显色15 min后终止。测定450 nm吸光度(A450nm)值。将A450nm值在0.4～0.6之间的抗血清/多克隆抗体的稀释倍数作为其效价。

4.多克隆抗体和HRP标记抗血清先依次用50%和33%饱和硫酸铵盐析，再用琼脂糖凝胶Protein A亲和层析，获得高纯度的多克隆抗体［7］。最后用十二烷基磺酸钠-聚苯烯酰胺凝胶电泳进行鉴定。

用过碘酸盐氧化法对抗体Ab-3B进行HRP标记。再用ÄKTA蛋白纯化仪分离纯化并实时检测A280nm值，收集第1个蛋白峰，命名为酶标抗体HRP-Ab3B。

5.真菌(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA竞争法体系酶标板包被:用磷酸盐缓冲液稀释的(1，3)-β-D-葡聚糖作为包被液，37℃过夜包被，洗板后用封闭液封闭。样本处理:取300 μL血清样本，加入100 μL乙二胺四乙酸二钠处理液，振荡混匀，沸水浴3 min，10 000×g离心10 min。竞争法检测:酶标板上依次加入50 μL抗原标准品［(1， 3)-β-D-葡聚糖浓度为800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125和1.563 pg/mL］或处理后样本上清液，再加入50 μL适当浓度的酶标抗体HRPAb3B，混匀后37℃孵育60 min，洗板后加四甲基联苯胺底物溶液，37℃显色15 min后终止。测定A450nm值。

6.ELISA竞争法体系性能验证(1)线性: ELISA竞争法重复检测3次，计算线性相关系数; (2)检测限:将Tris-HCl样本稀释液作为样本，重复检测20次，用文献［8］的方法计算检测限;(3)回收率和重复性:用加100、25和6.25 pg/mL凝胶多糖的3种正常人血清作为样本，用处理液处理后重复检测10次;(4)交叉反应:将8种病原菌(结核分枝杆菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、烟曲霉、白念珠菌和隐球菌)干粉添加到健康人血清中并进行梯度稀释，样本经同样的方法处理后进行检测，观察非真菌抗原是否出现假阳性。

结果

一、抗血清效价和交叉试验

采集全血后分离的血清，用茯苓多糖、凝胶多糖、曲霉半乳甘露聚糖、念珠菌甘露聚糖、隐球菌荚膜多糖包被酶标板使用间接法进行检测。抗血清效价超过16 000的兔子有11只(除去与其它真菌多糖抗原存在严重交叉反应的3只)。其中(1，3)-β-D-葡聚糖免疫获得抗血清效价高，且与其它抗原交叉反应弱。选择其中效价最高的1B、2C、3B和6A的兔血清进行纯化。

二、多克隆抗体Ab-3B电泳鉴定

抗血清纯化的抗体中，Ab-3B效价最高，效价为16 000。对其进行电泳鉴定。根据Marker条带迁移率可知，抗体Ab-3B蛋白带的相对分子质量为50 000和25 000，与抗体轻链和重链的相对分子质量完全一致，且无其它杂蛋白条带。由此证明，纯化后抗体Ab-3B中无其它杂蛋白。见图1。

图1 多克隆抗体Ab-3B电泳图

三、ELISA竞争法检测体系验证

建立的ELISA竞争法检测体系的线性范围为3.125～200 pg/mL;重复检测3次，曲线拟合方程的r2值均＞0.98，见图2;检测限为2.130 pg/mL;含高、中和低浓度(100、25和6.25 pg/mL)抗原血清检测到浓度值依次为(97.80±9.53)、(26.50± 3.71)、(7.10±0.98)pg/mL，回收率为97.8%～113.6%，变异系数均＜15%;含10 μg/m L细菌病原菌(结核分枝杆菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、克雷伯菌和金黄色葡萄球菌)干粉的血清均无法检出(1，3)-β-D-葡聚糖，3种常见的真菌病原菌(低浓度的烟曲霉、白念球菌和高浓度的隐球菌)均能检测到(1，3)-β-D-葡聚糖。见表1。

图2 ELISA竞争法的标准曲线验证

表1 菌体干粉添加到血清ELISA竞争法检测结果对比(pg/mL)

讨论

本研究创新利用修饰的(1，3)-β-D-葡聚糖作为包被抗原，酶标抗体HRP-Ab3B作为检测抗体，成功建立了(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA竞争法检测体系。试验中使用的抗体Ab-3B具有很高的特异性，避免与其它真菌多糖的交叉反应。该检测体系不仅能从血清中检出低浓度的曲霉和白念珠菌(1，3)-β-D-葡聚糖，而且可以检测高浓度的隐球菌(1，3)-β-D-葡聚糖，与5种临床常见病原菌(结核分枝杆菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、克雷伯菌和金黄色葡萄球菌)无交叉反应。此外，本检测体系敏感性高，检测限为2.130 pg/m L，检测时间短，2 h内完成检测，提高了目前临床上(1，3)-β-D-葡聚糖鲎试剂检测方法的特异性。

本研究的创新点是把原来非特异性的鲎试验检测方法改变为特异性的ELISA检测方法，类似研究未见报道。原鲎试验方法特异性较差，内毒素污染、多糖类药物等都会使其呈假阳性，无法检测溶血、高脂、黄疸、浑浊等特殊样本。ELISA检测体系使用免疫学原理，因此不存在内毒素的干扰，溶血或其他特殊样本经处理液处理后也能正常检测。由此可见，相对于鲎试剂，ELISA具有明显优势。

本研究虽然建立了真菌(1，3)-β-D-葡聚糖ELISA竞争法检测体系，但是该体系的性能还需要进一步评估。如果该检测体系能成功应用于临床诊断，必将大大提高(1，3)-β-D-葡聚糖检测的特异性，降低对检测人员技术和实验室检测环境的要求，实现准确、简便、快捷诊断侵袭性真菌病。

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Preparation of polyclonal antibody and development of a com petitive ELISA for fungal(1，3)-beta-D-glucan

YAN Jun1，YANG Wei2，ZHAI Shuanzhu1，XUE Zhixin1，YU Peng1，ZHOU Zeqi1.(1.College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China;2.Tianjin Medical Instrument Technical Evaluation Center，Tianjin 300070，China)

ObjectiveTo develop a competitive enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)with high specificity and sensitivity for fungal(1，3)-beta-D-glucan.MethodsRabbit polyclonal antibody was produced by immunization with protein-conjugated(1，3)-beta-D-glucan and fungal extract.The highest titer and little crossreactivity polyclonal antibody was labeled with horseradish peroxidase(HRP)and purified.Finally，a competitive ELISA was established for fungal(1，3)-beta-D-glucan.ResultsThe linear range was 3.125-200 pg/mL.The recovery range for 100，25 and 6.25 pg/mL serum antigen was 97.8%-113.6%，and the coefficient of variation for repeated test was＜15%.The detection system could effectively detect low concentrations ofAspergillus fumigatusandCandida albicansand high concentration ofCryptococcus neoformansfrom serum samples.Meanwhile，the detection system demonstrated little interference against 5 kinds of pathogenic bacteria，includingMycobacterium tuberculosis，Escherichia coli，Salmonella，KlebsiellaandStaphylococcus aureus.ConclusionsA competitive ELISA is developed successfully for the detection of invasive fungal disease with(1，3)-beta-D-glucan used as a coated antigen and enzymelabeled antibody HRP-Ab3B used as a detection antibody.

(1，3)-beta-D-glucan;Enzyme-linked immunosorbent assay;Invasive fungal disease

1673-8640(2015)09-0931-03

R446.61

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.015

2015-02-25)

(本文编辑:姜敏)

严俊，男，1987年生，硕士，主要从事临床微生物疾病早期诊断研究。