cornulin在宫颈病变中的表达及其差异

刁雯静，孙红，郭奇桑，王丽，陶祥，隋龙

(复旦大学附属妇产科医院检验科，上海200011)

cornulin在宫颈病变中的表达及其差异

刁雯静，孙红，郭奇桑，王丽，陶祥，隋龙

(复旦大学附属妇产科医院检验科，上海200011)

目的了解宫颈炎、宫颈癌前病变及宫颈癌组织中cornulin的表达情况，初步评价cornulin与宫颈癌变的相关性。方法收集各个级别的宫颈癌前病变及可疑宫颈癌患者行诊断性或治疗性经宫颈环形电切割术(LEEP)后的石蜡包埋组织标本131例，其中宫颈低级别鳞状上皮内病变(LSIL)39例、宫颈高级别鳞状上皮内病变(HSIL)49例、宫颈浸润癌(ICC)43例，以38例宫颈炎患者作为对照组。所有标本经兔抗人cornulin多克隆抗体免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法显示并评分。在行宫颈LEEP术之前取其宫颈脱落细胞，宫颈炎患者经阴道镜下活检病理诊断为慢性宫颈炎后取其宫颈脱落细胞，采用聚合酶链反应(PCR)测定cornulin基因的mRNA表达。结果免疫组化结果显示，除宫颈炎组与宫颈LSIL组之间无差异(P=0.148)外，其余各组间cornulin蛋白表达差异均有统计学意义(P均=0.000);随着宫颈病变级别的逐渐升高，cornulin蛋白表达逐渐下降，至ICC时表达明显降低;cornulin mRNA的表达与其蛋白表达一致。以cornulin弱阳性(+)或阴性(-)作为筛查阳性指标，检出宫颈HSIL以上病变的敏感性为70.7%，特异性为85.7%;检出宫颈LSIL以上病变的敏感性为56.5%，特异性为94.7%。结论cornulin有望成为检测宫颈病变程度的标记物之一。

cornulin;宫颈癌;免疫组化

宫颈癌的癌前病变亦称为宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)，少部分宫颈低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)可进一步发展为宫颈高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)，只有0.1%～0.2%的患者在2年内进一步发展为宫颈浸润癌(invasive cervical cancer，ICC)［1-2］。因此对于宫颈病变特别是宫颈LSIL的早期发现以及恰当的治疗就显得格外重要。目前，学者们更致力于研究宫颈癌前病变的组织学、分子生物学等方面的变化及其关系，寻找并发现相关的敏感指标，在帮助临床早期更准确诊断CIN的级别，从而制订个体化的治疗和随访方案，在有效阻断宫颈癌前病变进一步发展的前提下尽量减少不必要的过度治疗。

ARNOUK等［3］应用蛋白质组学分析了正常宫颈上皮、HSIL以及宫颈癌组织的激光捕获微切割(laser capture microdissection，LCM)样本，发现在23个明确鉴定出的差异蛋白中，cornulin是唯一一个可以全部特异区分3种不同性质组织的分子标志物，在正常宫颈上皮、HSIL以及宫颈癌组织的表达水平呈逐级降低。cornulin又称为CRNN、C1ORF10或SEP53，是融合基因家族中的一个新成员，融合基因家族即中间丝相关蛋白，该蛋白激酶家族定位于细胞浆内，多串联重复，而且在氨基端有EF手结构域(即Ca2+结合区域)，其被认为与表皮的终末分化密切相关。随着研究的深入，人们发现此家族成员在人体内参与调节表皮细胞生长及分化，蛋白结构的稳定性并与肿瘤的发展及预后密切相关。在表皮角化过程中与角质形成细胞的角蛋白丝相结合，被认为是角细胞分化的重要标志物［4-5］。大多数宫颈癌存在角细胞分化障碍，因此我们在ARNOUK等［3］研究的基础上扩大了样本量，并且设立了正常宫颈组织、宫颈LSIL、宫颈HSIL、ICC 4个组，欲了解cornulin在宫颈病变的不同阶段的表达差异情况，初步探讨cornulin表达与宫颈癌前病变以及宫颈癌发生的相互关系。

材料和方法

一、病例来源及取材

收集复旦大学附属妇产科医院宫颈科2009年10月份至2011年12月份收治的各个级别的宫颈癌前病变行经宫颈环形电切割术(loop electrosurgical excision procedure，LEEP)后的标本131例，患者术前均经阴道镜下活检病理明确诊断，且131例患者阴道镜下活检病理与其LEEP术后病理级别均一致。将患者按病理结果分为宫颈LSIL组39例(包括宫颈扁平湿疣13例、CIN I 26例)，宫颈HSIL组49例(包括CINⅡ4例、CINⅡ～Ⅲ14例、CINⅢ31例)，ICC组43例。并收集38例宫颈炎组织(阴道镜病理诊断为慢性宫颈炎)标本作为对照。所有患者取材前未行妇科检查，24 h内无性生活，并排除阴道炎症。所有切片均经过两位病理科医生诊断复核。

二、主要试剂

一抗兔抗人cornulin多克隆抗体(英国Abcam公司)、EnVision试剂盒(丹麦DAKO公司)、TRIZOL合成试剂盒(美国Invitrogen公司)、cDNA合成试剂盒(美国Fermentas公司)。Taq聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR) MasterMix试剂盒［天根生化科技(北京)有限公司］。

三、免疫组织化学法［免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(streptavidinperoxidase，SP)法］

将组织标本进行脱蜡、水化，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗2～3次，每次5 min。将3%H2O2(80%甲醇)滴加在玻璃片上，室温静置10 min，PBS洗2～3次，每次5 min。抗原修复:置0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH值6.0)中用煮沸(微波炉可高火4次，每次6 min)，自然冷却30 min以上至室温，PBS洗2～3次，每次5 min。滴加正常山羊血清封闭液，室温静置20 min，甩去多余液体。滴加一抗(兔抗人cornulin多克隆抗体)50 μL，室温静置1 h或4℃过夜或37℃1 h，如为4℃过夜后需在37℃复温45 min。PBS洗3次，每次5 min。滴加二抗(羊抗兔IgG)40～50 μL，室温或37℃静置1 h，二抗中可加入0.05%Tween-20。PBS洗3次，每次5 min。DAB显色5～10 min，在显微镜下掌握染色程度。PBS或自来水冲洗10 min。苏木精复染2 min，盐酸酒精分化，自来水冲洗10～15 min。最后脱水、透明、封片、镜检。

cornulin染色阳性以胞核和胞浆内出现棕黄色颗粒为主。染色判读标准:基本不着色为0分、着淡黄色为1分、着色适中为2分、着色深黄为3分;着色细胞占总细胞数＜5%为0分、5%～25%为1分、26%～50%为2分、＞50%为3分。将每张切片的着色程度得分和着色细胞数得分相乘为最后得分:0～1分为阴性(-)、2～3分为弱阳性(+)、4～5分为阳性(++)、6～9分为强阳性(+++)。

四、宫颈脱落细胞cornulin基因逆转录PCR (reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)检测

cornulin引物序列合成引物见表1，以β-actin为内参照。总反应体系为20 μL，含有cDNA 2 μL，2×PCR Master Mix 10 μL，每个引物(浓度为10 mmol/L)各1 μL。扩增条件:95℃预变性5 min;95℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s;各待检基因循环数经过优化以确保各自反应处于指数增长期，其中cornulin为32个循环，β-actin为30个循环;最后72℃延伸5 min。

表1 引物序列

五、统计学方法

采用SPSS 15.0软件进行统计分析。各组间样本率比较用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、cornulin蛋白的免疫组化结果

随着宫颈癌前病变级别的逐渐升高，cornulin蛋白的表达强度逐渐下降，至ICC时表达明显降低。见图1和表2。宫颈炎组cornulin蛋白表达与宫颈HSIL组、ICC组比较差异均有统计学意义(χ2值分别为41.597、60.850，P=0.000);宫颈LSIL组cornulin蛋白表达与宫颈HSIL组、ICC组比较差异均有统计学意义(χ2值分别为27.272、41.480，P=0.000);宫颈HSIL组cornulin蛋白表达与ICC组比较差异有统计学意义(χ2=15.656，P=0.000);宫颈炎组与宫颈LSIL组之间cornulin蛋白表达差异无统计学意义(χ2=5.343，P= 0.148)。

图1 不同病理级别宫颈病变cornulin蛋白的表达情况

二、cornulin作为ICC及其癌前病变筛查指标的敏感性以及特异性

以cormulin免疫组化(+)或(-)作为筛查阳性指标，对检出不同病理级别宫颈病变的“敏感性+特异性”达到最高，因此采用cornulin (+)/(-)作为ICC及其癌前病变的筛查阳性指标，以cornulin(++)/(+++)作为ICC及其癌前病变的筛查阴性指标。结果显示检出宫颈HSIL以上病变(即宫颈HSIL/ICC)的敏感性为70.7%、特异性为85.7%。检出宫颈LSIL以上病变(即宫颈LSIL/宫颈HSIL/ICC)的敏感性为56.5%、特异性为94.7%。见表3。

表2 各组cornulin免疫组化染色结果(例)

表3 cornulin作为ICC及其癌前病变筛查指标的敏感性以及特异性(%)

三、cornulin mRNA的RT-PCR结果

除宫颈炎组与宫颈LSIL组外，其余各组间cornulin mRNA表达差异均有统计学意义(P均＜0.05)，与cornulin蛋白的表达同步。见图2和表4。

图2 各组cornulin mRNA的RT-PCR结果

表4 cornulinmRNA的RT-PCR结果

讨论

现已发现ICC的发生、发展是多基因共同作用的结果。尽早发现并且治疗宫颈癌前病变可有效降低宫颈癌的发病率和死亡率。对于宫颈癌前病变准确的诊断和恰当的治疗不仅可有效阻断其向宫颈癌进一步发展，同时也避免不必要的过度治疗，提高患者的生活质量。

阴道镜下活检的准确性主要决定于阴道镜医生的经验和判断，根据美国阴道镜检查与宫颈病理学会(American Society for Colposcopy and Cervical Pathology，ASCCP)的诊疗指南，经阴道镜下活检为宫颈LSIL患者后续治疗主要是根据其新柏氏液基细胞学(thinprep cytologic test，TCT)检测结果［6］，但前提是阴道镜下活检准确率在一定的质控范围内。由于我国医疗资源的缺乏，特别是偏远地区有资质的阴道镜医生有限，有些医生甚至在肉眼下进行宫颈活检，往往得出的结果是片面的，宫颈病变漏诊率非常高。后续的LEEP术在弥补了许多病例可能漏诊的同时，也提高了过度治疗的概率。然而，宫颈LSIL的过度治疗亦存在很大弊端。LEEP也有高达13.2%的围术期并发症，常见的有术中或术后出血、感染等，且发生率随切除组织量和深度的增加而升高［7］，部分病例LEEP术后发生宫颈或颈管部位的子宫内膜异位［8］，LEEP还与术后妊娠合并足月前胎膜早破、早产及低出生体重儿风险增高有关［9］。

那么在缺乏医疗资源的地区怎样判断阴道镜下活检提示阳性者，特别是宫颈LSIL患者是否需要进一步行LEEP术呢?除了参考其TCT结果外，还需要寻求更多准确、客观地指标来进一步确诊其病理级别，在不漏诊的前提下尽量避免不必要的治疗带来的身心损伤。

ARNOUK等［3］发现了cornulin是一个可以全部特异区分3种不同性质宫颈组织的分子标志物。鉴于宫颈LSIL治疗的多样性和可选择性，本研究在ARNOUK等［3］的实验基础上加入了宫颈LSIL组，并且除了观察cornulin蛋白的差异情况，还增加了对cornulin mRNA的RT-PCR的研究。结果显示除了宫颈炎(即正常宫颈上皮)组和宫颈LSIL组之间cornulin蛋白和cornulin mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05)外，其余各组之间无论cornulin蛋白还是cornulin mRNA的表达差异均有统计学意义(P均＜0.05)。

关于cornulin的生物学功能目前仍少有研究。有研究发现cornulin在鳞状上皮应激反应过程中表达增加，提示其可能是一种热休克蛋白［10］。cornulin基因在舌鳞癌、食管鳞癌［11］、宫颈癌组织中的表达均降低，其可能在部分鳞癌的发生、发展中通过细胞周期阻滞作用反向调节癌细胞的增殖。

由于80%以上的宫颈癌存在角细胞分化障碍，cornulin在宫颈癌组织中往往呈低表达。本研究结果进一步证实了随着宫颈病变病理级别的逐渐升高，cornulin蛋白的表达强度逐渐下降，至ICC时cornulin蛋白表达明显减低，并且cornulin mRNA的表达与其蛋白同步。另外本研究以cornulin(+)/(-)作为阳性筛查指标，检出宫颈HSIL以上病变的敏感性为70.7%、特异性为85.7%，检出宫颈LSIL以上病变的敏感性为56.5%，特异性为94.7%。因此将cornulin作为筛查指标对于检出宫颈不同级别病变均有较高的特异性。cornulin可能有望成为辅助诊断宫颈LSIL和宫颈HSIL以上病变的特异性筛查指标。临床上结合患者TCT病理诊断结果使有宫颈病变的患者可以得到一个更全面的评估，可以给患者特别是宫颈LSIL的患者提供更多元化的治疗方案。然而，cornulin将来是否可以实际应用于临床仍需更大样本量、更深层次的相关研究。

［1］SCHIFFMAN M，WENTZENSEN N.From human papillomavirus to cervical cancer［J］.Obstet Gynecol，2010，116(1):177-185.

［2］WHEELER CM.Natural history of human papillomavirus infections，cytologic and histologic abnormalities，and cancer［J］.Obstet Gynecol Clin North Am，2008，35(4):519-536.

［3］ARNOUK H，MERKLEY MA，PODOLSKY RH，et al.Characterization of molecular markers indicative of cervical cancer progression［J］.Proteomics Clin Appl，2009，3(5):516-527.

［4］LIEDÉN A，EKELUND E，KUO IC，et al.Cornulin，a marker of late epidermal differentiation，is downregulated in eczema［J］.Allergy，2009，64(2):304-311.

［5］CONTZLER R，FAVRE B，HUBER M，et al.Cornulin，a new member of the"fused gene"family，is expressed during epidermal differentiation［J］.J Invest Dermatol，2005，124(5):990-997.

［6］APGAR BS，KITTENDORF AL，BETTCHER CM，et al.Update on ASCCP consensus guidelines for abnormal cervical screening tests and cervical histology［J］.Am Fam Physician，2009，80(2):147-155.

［7］SUTTHICHON P，KIETPEERAKOOL C.Perioperative complications of an outpatient loop electrosurgical excision procedure:a review of 857 consecutive cases［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2009，10(3):351-354.

［8］WONG FW，LIM CE，KARIA S，et al.Cervical endometriosis:case series and review of literature［J］.J Obstet Gynaecol Res，2010，36(4):916-919.

［9］ARMARNIK S，SHEINER E，PIURA B，et al.Obstetric outcome following cervical conization［J］.Arch Gynecol Obstet，2011，283(4):765-769.

［10］MERKLEY MA，WEINBERGER PM，JACKSON LL，et al.2D-DIGE proteomic characterization of head and neck squamous cell carcinoma［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，2009，141(5):626-632.

［11］PAWAR H，MAHARUDRAIAH J，KASHYAP MK，et al.Downregulation of cornulin in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Acta Histochem，2013，115(2):89-99.

The exp ression and its difference of cornulin in cervical lesions

DIAO Wenjing，SUN Hong，GUO Qisang，WANG Li，TAO Xiang，SUI Long.(Department of Clinical Laboratory，Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University，Shanghai 200011，China)

ObjectiveTo study the cornulin expressions in cervicitis tissue，cervical intraepithelial neoplasia tissue and cervical cancer tissue，and to evaluate preliminarily the correlation of cornulin with cervical intraepithelial neoplasia tissue.MethodsA total of 131 paraffin-embedded tissue samples were collected from cervical intraepithelial neoplasia and suspicious cervical cancer patients undergoing loop electrosurgical excision procedure(LEEP)for diagnostics or treatment.They included 39 patients with low-grade squamous intraepithelial lesion(LSIL)，49 patients with high-grade squamous intraepithelial lesion(HSIL)，43 patients with invasive cervical cancer(ICC)，and 38 patients with cervicitis were enrolled as control group.Immunohistochemistry［streptavidin-peroxidase(SP)］using a rabbit polyclonal antibody against human cornulin was applied in all samples.Polymerase chain reaction(PCR)was used for the determination ofcornulinmRNA expression in all 131 patients＇cervical thinprep cytologic test samples prior to cervical LEEP procedure and control group＇s cervical thinprep cytologic test samp les after histopathology diagnosis by colposcopy.ResultsImmunohistochemistry showed that the expression levels of cornulin were significantly different with the other groups(P=0.000)except that between LSIL and control group(P=0.148).With the severity degree of cervical disease increasing，the expression of cornulin decreased，and it decreased significantly in ICC.The expression of cornulin mRNA was consistent with the results of cornulin expression level.If taking cornulin weakly positive(+)or negative(-)as the cut-off for screening cervical HSIL or higher，the sensitivity was 70.7%，and the specificity was 85.7%.And for screening cervial LSIL or higher，the sensitivity was 56.5%，and the specificity was 94.7%.ConclusionsCornulin might be one of the useful markers for cervical carcinogenesis.

Cornulin;Cervical cancer;Immunohistochemistry

1673-8640(2015)09-0898-05

R446.1

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.008

2014-11-30)

(本文编辑:龚晓霖)

中国癌症基金会资助项目(E12012001)

刁雯静，女，1979年生，硕士，主治医师，主要从事妇产科相关疾病的检验工作。

孙红，联系电话:021-63455050。