免疫性不孕症患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞、叉头状转录因子3、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的水平研究

马兴璇 孙一帆 生淑亭 韦丽丽 刘春明 张红雨 吴玉芬 王林春 龙康

1.广西壮族自治区柳州市中医院检验科，广西柳州545001；2.广西壮族自治区柳州市中医院妇科，广西柳州545001；3.广西壮族自治区柳州市中医院中心实验室，广西柳州545001

免疫性不孕症患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞、叉头状转录因子3、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的水平研究

马兴璇1孙一帆1生淑亭2韦丽丽2刘春明1张红雨1吴玉芬3王林春1龙康1

1.广西壮族自治区柳州市中医院检验科，广西柳州545001；2.广西壮族自治区柳州市中医院妇科，广西柳州545001；3.广西壮族自治区柳州市中医院中心实验室，广西柳州545001

目的探讨外周血CD4+CD25+调节性T细胞（CD4+CD25+Treg）、叉头状转录因子3（Foxp3）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）与免疫性不孕的关系，为免疫性不孕的诊断和治疗提供依据。方法用流式细胞仪检测60例免疫性不孕妇女（研究组）和60例正常妊娠的育龄妇女（对照组）外周血中CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4水平，并对检测结果进行统计学分析。结果研究组外周血中CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4水平值分别为：（3.66±0.59）%、（2.97±0.63）%、（3.17±0.36）%，均低于对照组［（8.17±0.63）%、（7.17±0.53）%、（8.21±0.56）%］，两组比较差异均有高度统计学意义（均P＜0.01）。结论免疫性不孕症患者外周血中CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4的表达水平比正常妊娠的育龄妇女少，CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4表达的降低可能是免疫性不孕的重要原因。

CD4+CD25+调节性T细胞；免疫性不孕；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4；叉头状转录因子3

目前免疫性不孕的诊断标准是：夫妇双方同居一年以上，其他检查结果均正常，而由女方血清抗精子抗体（ASAb）和（或）抗卵透明带抗体（ZPAb）阳性引起的不孕［1］，它是妇科的常见病之一。据统计，已婚妇女中约20%患有不孕症，其中20%～40%属于免疫性不孕，由于多种因素的影响，近年来发病率有上升的趋势［2-3］。但长期以来免疫性不孕的病因不明确，特别是分子和细胞水平的研究几乎空白，评价诊断和治疗效果缺乏量化的指标。研究表明，CD4+CD25+调节性T细胞（CD4+CD25+Treg）与免疫性疾病密切相关，其数量和功能异常是免疫性疾病的病因之一。为了探明外周血中CD4+CD25+Treg与免疫性不孕的关系，笔者对60例免疫性不孕妇女外周血中的CD4+CD25+Treg、叉头状转录因子3（Foxp3）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）进行了对照研究，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 标本来源

研究组：收集2014年6～10月在广西壮族自治区柳州市中医院（以下简称“我院”）妇科门诊就诊并经过检查确诊的免疫性不孕妇女60例，年龄24～41岁，平均（32±6）岁。对照组：收集2014年6～9月在我院妇科门诊做人工流产术的健康育龄妇女60例，年龄16～43岁，平均（28±7）岁。研究组和对照组平均年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器

1.2.1.1 主要试剂藻红蛋白（PE）结合的CD4-PE单抗和异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CD25-FITC单抗、PE藻青蛋白标记（APC）标记的鼠抗人CTLA-4抗体、APC Foxp3单抗及配套染色试剂均购自美国BD公司。

1.2.1.2 仪器美国BD公司生产的FACS Calibur型流式细胞仪。

1.2.2 检测方法

清晨空腹采集2 mL静脉血，EDTA-2K抗凝，以淋巴细胞分离液获得单个核细胞，计数，调整细胞悬液浓度为1×107/mL，取样100 μL，分别加入10 μL CD4、CD25、CTLA-4、Foxp3抗体，室温下避光10 min，加溶血素2 mL后再避光15 min，根据红细胞的裂解状态，以1500 r/min离心5 min，弃去上清液，加磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤1次，再加300 μL PBS液混匀，上流式细胞仪进行检测。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 16.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

研究组外周血中CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4水平均低于对照组，两组比较差异均有高度统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 两组外周血中的CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4水平比较

表1 两组外周血中的CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4水平比较

注：CD4+CD25+Treg：CD4+CD25+调节性T细胞；Foxp3：叉头状转录因子3；CTLA-4：细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4

组别CD4+CD25+TregFoxp3CTLA-4研究组对照组t值P值3.66±0.59 8.17±0.63 3.82＜0.01 2.97±0.63 7.17±0.53 3.63＜0.01 3.17±0.36 8.21±0.56 3.46＜0.01

3 讨论

与免疫性不孕相关的免疫性抗体的研究报道很多，包括ASAb、ZPAb、抗子宫内膜抗体（EmAb）、抗心磷脂抗体（AcAb）、抗卵巢抗体（AoAb）等，但目前只有ASAb、ZPAb已通过动物实验得到证实［4］。ASAb可从多个环节影响不孕［5-9］：①干扰精子获能、顶体反应及受孕：宫颈黏液中含有抗凝血酶和蛋白酶抑制剂，可抑制精子顶体酶系的活性，影响精子获得能量。表面带的免疫球蛋白的精子，在通过宫颈黏液时，可与黏液中受体片段结合，发挥作用，从而阻碍精卵结合。②清除女性生殖道精子：通过补体介导，ASAb激活巨噬细胞发挥对精子的吞噬作用，加速清除女性生殖道内精子，降低精子密度，影响受精。透明带（ZP）Ab可通过以下机制导致不孕［10-14］：由于ZPAb结合在ZP上，即使卵子与精子能够结合成为受精卵，受精卵也会受到一定的损伤，因此导致不孕；由于ZPAb能与ZP结合，干扰不透明带上的精子受体，使卵子与精子不能相互发现而结合成为受精卵；由于卵巢的损伤，使卵巢分泌与妊娠相关的激素减少，导致子宫内膜分泌女性激素不足或分泌减少，造成不孕；由于卵巢的在ZPAb的作用下，容易发生炎症等，使卵泡发育不是很好或者导致排卵困难或不能排卵。同时ASAb和（或）ZPAb的检测结果只能定性，不能定量，并且检测的结果影响因素很多，特异性低，很多妇科疾病都会引起ASAb和（或）ZPAb阳性，所以针对免疫性不孕的诊断和治疗亟需寻找一个可以量化的指标。

CD4+CD25+Treg是重要的免疫调节细胞，CD4+CD25+Treg的功能特点［15］：①CD4+CD25+Treg在体内主要作用是发挥免疫自稳功能，去除或减少血液中CD4+CD25+Treg，则可引发多种自身免疫性疾病，而输入CD4+CD25+Treg则可抑制多种自身免疫性疾病发生。②CD4+CD25+Treg不但可以在胸腺内生成，在外周也可以产生。如果CD4+CD25+Treg在血液中的比例或功能发生改变，容易引起多种与免疫有关的疾病。

CD4+CD25+Treg的表型标记主要包括CTLA-4和Foxp3等。CTLA-4的主要作用是CD4+CD25+Treg在被激活后，CTLA-4可从细胞内转而组成性表达在细胞表面，细胞表面的CTLA-4分子在免疫调节中发挥重要作用。Foxp3的主要作用是它的表达可使CD4+CD25+调节性T细胞分化为CD4+CD25+Treg，并发挥免疫抑制作用。但是Foxp3对CD4+CD25+Treg的调节机制还不清楚，有待于进一步研究。由于CTLA-4和Foxp3都能在CD4+CD25+Treg上表达，所以可以通过检测T淋巴细胞中的CTLA-4和（或）Foxp3的比例和功能，从而间接了解CD4+CD25+Treg在T淋巴细胞中的比例和功能。

国内外很多学者通过研究发现：人类妊娠蜕膜中含大量的CD4+CD25+Treg。CD4+CD25+Treg有可能在人类妊娠的过程中发挥了重要作用，它在T淋巴细胞中的功能和数量的失调可能将影响妊娠的结局。通过动态跟踪检测发现，在整个妊娠的过程中CD4+CD25+Treg的比例在逐渐增高，从早期妊娠到足月时蜕膜中CD4+CD25+Treg占CD4+T细胞的9%～15%。根据这些细胞的特征，这些被确认的T细胞在人类蜕膜中显示出CD4+CD25+Treg的表型［16-18］。这些高表达的表型包括CTLA-4、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子以及Foxp3等［19］。同时研究还发现：CD4+CD25+Treg在早期妊娠妇女外周血中升高，至中期妊娠达到最高峰，而产后数量下降，所以妊娠期间CD4+CD25+Treg是动态变化的［20-21］，提示妊娠时全身CD4+CD25+Treg存在系统扩增，并且还证实CD4+CD25+Treg的扩增不是被同种抗原驱使的，而是被妊娠本身驱使的。妊娠时CD4+CD25+Treg绝对数量的增加预示其更强的免疫耐受环境，这是母胎耐受所需。Aluihare等［20］研究显示调节性T细胞募集或功能可能在不孕症中受到损害，不孕症可能与免疫耐受的受损相关。

笔者通过研究发现：研究组外周血中的CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4数量与对照组比较差异均有高度统计学意义（P＜0.01），免疫性不孕患者外周血中的CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4表达明显低于能正常妊娠的育龄妇女。CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4表达降低可能是免疫性不孕的病因之一，通过免疫抑制剂治疗，提高患者体内的CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4表达可能是治疗免疫性不孕的重要手段。但CD4+CD25+Treg、Foxp3、CTLA-4在免疫性不孕中如何发挥作用，它的调节机制仍有待于进一步研究。

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Research on relationship between frequency of circulating CD4+CD25+Treg,Foxp3,CTLA-4 and immunological infertility

MA Xingxuan1SUN Yifan1SHENG Shuting2WEI Lili2LIU Chunming1ZHANG Hongyu1WU Yufen3WANG Linchun1LONG Kang1
1.Department of Chinical Laboratory,the Hospital of Traditional Chinese Medicinal of Liuzhou City,Guangxi Zhuang Autonomous Region,Liuzhou545001,China;2.Department of Gynaecology,the Hospital of Traditional Chinese Medicinal of Liuzhou City,Guangxi Zhuang Autonomous Region,Liuzhou545001,China;3.Department of Central Laboratory,the Hospital of Traditional Chinese Medicinal of Liuzhou City,Guangxi Zhuang Autonomous Region,Liuzhou545001,China

ObjectiveTo investigate the relationship between the frequency of circulating CD4+CD25+Treg,Foxp3, CTLA-4 and immunological infertility,and to provide the basis for the diagnosis and treatment of immunological infertility.MethodsThe levels of the circulating CD4+CD25+Treg,Foxp3,CTLA-4 were detected by flow cytometry(FCM) in 60 cases of immunological infertility women(study group)and 60 cases of health gestation age women(control group), and the results were analyzed with statistics.ResultsThe levels of the CD4+CD25+Treg,Foxp3,CTLA-4 in peripheral blood of the study group were(3.66±0.59)%,(2.97±0.63)%,(3.17±0.36)%,which were lower than those of the control group［(8.17±0.63)%,(7.17±0.53)%,(8.21±0.56)%］,the differences between the two groups had statistical significances (allP＜0.01).ConclusionThe levels of the CD4+CD25+Treg,Foxp3,CTLA-4 in immunological infertility women have significantly decreased,which suggestes that the reduce of the gestation CD4+CD25+Treg,Foxp3,CTLA-4 may play an important role in female immunological infertility.

CD4+CD25+regulatory T cells;Immunological infertility;Cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4;Foxp3

R714.21

A

1673-7210（2015）02（a）-0088-04

2014-11-10本文编辑：卫轲）

广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研课题（编号Z2014443）。