土荆皮酸对人肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及其机制

余景伟 胡克

武汉大学人民医院呼吸科，湖北武汉430060

土荆皮酸对人肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及其机制

余景伟 胡克

武汉大学人民医院呼吸科，湖北武汉430060

目的探讨土荆皮酸对肺癌细胞系A549细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法体外培养的A549细胞，用不同浓度的土荆皮酸（0、4、8、16、32 μmol/L）处理24、48、72 h，MTT法测定其对A549细胞增殖的影响；土荆皮酸（0、4、8、16 μmol/L）处理A549细胞48 h后，流式细胞仪检测细胞凋亡和周期，分光光度计检测Casepase-3相对活性，Western blot法检测PTEN、Akt、p-Akt的表达。结果土荆皮酸能有效抑制A549细胞增殖，且呈浓度和时间依赖性（P＜0.05）；土荆皮酸作用A549细胞48 h后，细胞凋亡率从14.8%上升至37.7%，显著高于对照组（土荆皮酸0 μmol/L）（P＜0.05）；流式细胞仪检测结果显示，土荆皮酸能抑制细胞的G1期行进和G1/S转换；Casepase-3相对活性显著增加（P＜0.05）；土荆皮酸可上调PTEN表达并抑制p-Akt的表达（P＜0.05）。结论土荆皮酸可抑制A549细胞增殖并促进其凋亡，其作用机制可能与上调PTEN并抑制Akt信号通路，继而阻滞细胞周期并激活线粒体凋亡途径相关。

土荆皮酸；A549细胞；凋亡；PTEN；Akt信号通路

肺癌是全球范围内发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一［1-2］，化疗是主要的治疗方法，然而传统的化疗药物毒副作用大，患者难以耐受，且常常出现耐药情况，治疗效果不佳。因此，从天然植物中寻找高效低毒的具有抗肿瘤活性的成分成为了国内外研究热点。土荆皮酸（Pseudolaric acid B，PAB）是从荆树皮中提取的具有多种药理活性的二萜类化合物，前期研究发现，PAB可抑制多种肿瘤细胞增殖，并诱导细胞凋亡［3-4］，然而其抗肿瘤机制尚不明确，本研究旨在探讨PAB对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响，并探讨PAB可能的抗肿瘤作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞株：肺癌细胞系A549细胞，购于中国科学院上海细胞库。主要试剂：PAB购于哈尔滨弘博生物科技有限公司，细胞周期检测试剂盒和AnnexinV/PI凋亡试剂盒购于BENDER公司；胎牛血清、RPMI1640培养液购于碧云天生物技术研究所；四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂盒、辣根酶标记山羊抗兔或山羊抗鼠IgG均购自武汉博士德生物科技有限公司；Caspase-3活性检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司；PTEN、Akt、p-Akt（Ser473）及内参β-actin抗体均购自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养A549细胞培养于含10%胎牛血清RPMI 1640培养基，置于细胞培养箱中培养，对于贴壁细胞培养方法，大约每2天换培养基1次，大约3 d传代1次，每次均取生长状态良好的并处于对数期的细胞进行实验。

1.2.2 细胞增殖实验检测细胞活力将对数生长期的细胞配制成1×104个/mL的细胞混悬液，将混悬液按每孔100 μL加入96孔培养板，在孵箱中孵育培养约24 h后取出，弃上清，每孔加200 μL RPMI-1640培养液再培养24 h后取出，弃上清。实验组换PAB终浓度为2、4、8、16、32 μmol/L培养液，对照组未加PAB（0 μmol/L），每组5个复孔。然后放置培养箱中继续孵育24、48、72 h，于实验结束前4 h弃孔内液体，每孔加入100 μL MTT（浓度为0.5 mg/mL），培养4 h，弃孔内液体，加入100 μL DMSO。振荡15 min后酶标仪测吸光度（A490），根据公式计算细胞抑制率：细胞抑制率（%）=1-（实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡将对数生长期的细胞配制成1×106个/mL的细胞混悬液，将悬液接种于6孔板中，在孵箱中孵育培养约24 h后取出，弃上清。实验组换PAB终浓度为2、4、8、16、32 μmol/L培养液，对照组未加PAB（0 μmol/L），放置培养箱中继续孵育48 h后收集细胞，预冷PBS洗涤细胞2次，并将细胞重悬于Binding Buffer中。加入5 μL Annexin VFITC室温、避光反应10 min，加入5 μL PI混匀，室温、避光反应5 min。筛网过滤后，上流式细胞仪机检测细胞凋亡率。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期细胞接种及分组同上，收集细胞，洗涤、离心后加入75%预冷乙醇固定过夜，弃掉乙醇，加入RNase和PI室温避光染色，筛网过滤后，送上流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.5 分光光度法检测Caspase-3活性变化细胞接种及分组同上，收集细胞，加入100 μL裂解液+ 1.742 μL PMSF蛋白酶抑制剂重悬细胞，用移液器吹打细胞置混匀，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上裂解约45 min。后12 000 r/min，4℃离心30 min，后吸取上清，并放置于冰上，用BCA法测定蛋白浓度，根据Caspase-3活性检测试剂盒操作方法操作，其原理是基于Caspase-3可催化底物Ac-DEVD-pNA并产生黄色的对硝基苯胺（p-nitroaniline，pNA），后者可产生吸光度，间接反映细胞内Caspase-3活性。根据结果调好蛋白浓度（2～4 g/L），再加入缓冲液20 μL多次吹打均匀后加入Caspase-3反应底物Ac-LEHD-pNA 5 μL，再放置培养箱中避光孵育4 h，之后酶标仪测定405 nm处吸光值（OD405）。

1.2.6 Western blot检测PTEN、Akt和p-Akt（Ser473）蛋白表达细胞接种及分组同上，收集细胞，加入100 μL裂解液+1.742 μL苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制剂重悬细胞，用移液器吹打细胞置混匀，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上裂解约45 min。12 000 r/min，4℃离心30 min，后吸取上清，将样品分装至预冷的EP管中，-80℃保存。BCA法测定蛋白质浓度，加入1/5体积的5×上样缓冲液至提取的细胞蛋白样品中，沸水煮沸5 min，-20℃保存。将细胞蛋白样品行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（上样量20 μg/孔），电泳结束后转膜至PVDF膜，再加入5%脱脂奶粉，室温封闭1 h，根据条带蛋白分布不同加入1∶1000稀释的兔抗或鼠抗人PTEN、Akt、p-Akt（Ser473）抗体，4℃冰箱内过夜，其中β-actin为内参，次日洗膜缓冲液（TBST）洗膜后，根据一抗来源不同分别加入1∶1000稀释的辣根酶标记的山羊抗或山羊抗鼠二抗，室温放置2 h，再次TBST洗膜后加入ECL发光液显色，暗室内显影并观察各条带深浅变化。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PAB对A549细胞活力的影响

如表1所示，PAB对A549细胞的增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性，药物浓度越高、作用时间越长，其发挥抗肿瘤作用效果亦越好。

表1 土荆皮酸对A549细胞增殖的影响

2.2 土荆皮酸对A549细胞凋亡的影响

A549细胞经PAB处理48 h后，流式细胞仪凋亡检测结果显示，PAB各实验组的细胞凋亡率较对照组（0 μmol/L）的凋亡率（0.6%）明显升高，从14.8%上升至37.7%，较对照组的凋亡率（0.6%）明显升高（P＜ 0.05）。表明PAB能诱导细胞凋亡。见图1。

图1 土荆皮酸对肺癌A549细胞凋亡率的影响

2.3 PAB对A549细胞周期的影响

流式细胞仪检测细胞周期数据显示，PAB能抑制A549细胞的G1期行进和G1/S转换，S期细胞比例降低，表示PAB能够阻滞细胞周期。见图2。

2.4 土荆皮酸对A549细胞Caspase-3活性的影响

Caspase-3活性检测结果显示，PAB（4、8、16 μmol/L）处理后，A549细胞Caspase-3相对活性较对照组（0 μmol/L）明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图2 土荆皮酸对肺癌A549细胞周期的影响

2.5 土荆皮酸对A549细胞PTEN、Akt、p-Akt表达的影响

PAB（4、8、16μmol/L）作用A549细胞48h后，Western blot检测PTEN、Akt、p-Akt，如图4所示，细胞PTEN表达增加，总的Akt表达量没有变化，而p-Akt表达减少，呈浓度依赖性，灰度值分析显示，PAB（4、8、16 μmol/L）与对照组（0 μmol/L）比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。表明PAB能上调PTEN，抑制Akt磷酸化。

3 讨论

细胞凋亡机制在维持机体内环境稳定中扮演着重要角色，是重要的生理调控机制［5］，细胞无限增殖及细胞凋亡相对或绝对数不足在肿瘤发生发展中具有重要意义［6］，诱导细胞凋亡可能是抗肿瘤治疗最有效的途径之一，因此，针对诱导细胞凋亡机制的药物，特别是天然化合物的研究已经成为国内外抗肿瘤研究的热点。本实验结果发现，PAB对A549细胞的增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性，药物浓度越高、作用时间越长，其发挥抗肿瘤作用效果亦越好。本研究还检测了PAB处理A549细胞后细胞周期改变，结果显示，PAB能阻滞A549细胞的G1期行进和G1/S转换，导致S期细胞比例降低，提示PAB可能通过阻滞细胞周期抑制细胞增殖。此外，本研究进一步探讨了PAB对是否通过诱导细胞凋亡发挥抑制细胞的增殖作用。结果显示，PAB处理A549细胞后，细胞凋亡率随着药物浓度的升高而明显升高。上述表明PAB能抑制肺癌细胞增殖，同时促进细胞凋亡。

图3 土荆皮酸对肺癌A549细胞Caspase-3相对活性的影响

图4 土荆皮酸对肺癌A549细胞PTEN、Akt、p-Akt表达的影响

关于细胞凋亡的途径及信号通路，目前研究发现的细胞凋亡途径主要包括内部线粒体途径、外部死亡受体途径及内质网应激途径。Caspase作为半胱氨酸蛋白酶类，其家族在内部线粒体凋亡途径中起着重要作用，可特异性切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键，是导致凋亡的直接效应物。其中Caspase-3是效应凋亡蛋白酶，其被切割活化后，细胞凋亡则进入不可逆转阶段［7］。Caspase-3在起始凋亡蛋白酶切割激活活化后，可通过裂解细胞凋亡抑制蛋白、细胞DNA修复相关分子、细胞骨架蛋白和细胞外基质蛋白等机制，最终促进细胞凋亡。本研究发现，PAB处理后，A549细胞内Caspase-3活性显著升高，提示PAB可能通过线粒体途径诱导肺癌A549细胞凋亡。

本研究进一步探讨了PAB引起凋亡的机制。磷酸酶基因（phosphatase and tensin homologue deleted in chromosome，PTEN）是1997年发现并命名的一种具有双重特异性磷酸酶活性抑癌基因，因其在多种进展期肿瘤中均发生突变，又被称为多发性进展期肿瘤突变基因（mutated in multiple advanced cancer-1，MMAC-1）。研究发现，PTEN基因在多种肿瘤细胞包括大肠癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌、恶性胶质瘤、肺癌中突变，表达下调甚至缺失［8-11］。已经证实，PTEN发挥抑癌作用主要依靠其磷酸酶活性作用于PI3K的下游靶分子PI3P，进而阻断PI3K/AKT信号通路，即PTENPI3K/AKT信号通路［12-13］。PTEN基因的失活导致PI3K/AKT信号通路异常活化，异常活化的AKT继而产生促进肿瘤细胞增殖，抑制细胞凋亡，增强肿瘤细胞黏附、侵袭及转移能力，促进血管生成等多种生物学效应［14］，在肿瘤发生发展过程中具有极其重要意义。本研究发现，PAB处理A549细胞后，细胞PTEN表达上调，同时，细胞总的Akt表达量没有变化，而p-Akt表达减少，两者表达呈负相关，表明PAB能上调PTEN从而抑制Akt信号通路。

综上所述，本研究结果发现PAB可抑制A549细胞增殖，并促进细胞凋亡，其机制可能与PAB上调抑癌基因PTEN从而抑制Akt信号通路，继而阻滞细胞周期并激活线粒体凋亡途径相关。有关PAB的潜在抗肿瘤机制尚需进一步深入探索和研究。

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Effects of Pseudolaric acid B on cell proliferation and apoptosis in lung cancer A549 cells and its mechanism

YU JingweiHU Ke
Department of Pneumology,Renmin Hospital of Wuhan University,Hubei Province,Wuhan430060,China

ObjectiveTo investigate the effects of Pseudolaric acid B on the cell proliferation and apoptosis in lung cancer line A549 cells and discuss the possible mechanisms.MethodsA549 cells were cultured in vitro.After treatment by Pseudolaric acid B of different concentrations(0,4,8,16,32 μmol/L)respectively for 24,48,72 h,the influence of Pseudolaric acid B on the proliferation of A549 cells were determined by the MTT method.After treatment by Pseudolaric acid B of different concentrations(0,4,8,16 μmol/L)for 48 h,the cells apoptosis and cycle were detected by flow cytometry;the relative activity of caspase-3 was monitored by spectrophotometer;the expression of PTEN,Akt and p-Aktproteins were detected by the Western blot.ResultsFrom the data of MTT,the cell proliferation of A549 cells was inhibited by Pseudolaric acid B,and in a dose-dependent and time-dependent manner(P＜0.05).Annexin V-FITC/PI staining showed that Pseudolaric acid B significantly induced cell apoptosis.After treated with Pseudolaric acid B,the apoptosis rate of A549 cells increased from 11.6%to 34.5%,which showed an obvious concentration-effect relationship(P＜0.05).Flow cytometry assays demonstrated that Pseudolaric acid B blocked the cell cycle at the G1and G1to S transition,and the percentage of S-phase cells decreased obviously.The relative activity of caspase-3 of Pseudolaric acid B was increased(P＜0.05).The treatment with Pseudolaric acid B promoted the expression of PTEN, and suppressed the expression of p-Aktin a dose-dependent manner(P＜0.05).ConclusionPseudolaric acid B inhibits the cell proliferation and induces cell apoptosis in A549 cells,and the effects of antitumor may be associated with up-regulation of PTEN and inhibition of the Akt signaling pathway,thus blocking the cell cycle and activating mitochondria apoptosis pathway.

Pseudolaric acid B;A549 cell;Apoptosis;PTEN;Akt signaling pathway

R734

A

1673-7210（2015）02（a）-0018-05

2014-10-14本文编辑：任念）

余景伟（1975.5-），男，武汉大学人民医院呼吸内科2010级在读硕士研究生；研究方向：呼吸系统疾病及诊断。

胡克（1965.11-），男，医学博士，教授，博士生导师，武汉大学人民医院呼吸科主任；研究方向：呼吸系统疾病及诊断。