棘托竹荪菌托抑菌物质提取、分离及活性组分

林陈强，林戎斌，陈济琛，张 慧，林新坚

福建省农业科学院土壤肥料研究所农业资源与环境研究中心，福州 350013

竹荪［Dictyophora indusiata(Vent.ex Pers)Fisch］为鬼笔科(Phallaceae)竹荪属(Dictyophora)大型食用菌，是一种产于亚洲热带地区的珍稀药用菌［1］。

竹荪具有抑菌防腐的作用［2，3］。民间发现竹荪与肉共煮，可使肉汤保存较长时间而不致于腐败变质。因此，竹荪中的抑菌活性物质具有开发成天然防腐剂的潜在价值［4，5］。目前对竹荪抑菌的研究主要以竹荪水提物［6-8］和有机溶剂(如乙醇［5，8，9］、乙酸乙酯［2，3，10］、石油醚［11，12］、正己烷［13］、丙酮［14］等)提取物为抑菌样液。通过抑菌研究发现，竹荪提取物对霉菌、酵母及细菌具有广泛的抑菌效果。竹荪抑菌作用的报道多数建立在粗提物上，对抑菌成分的化学基础研究较少。

竹荪成熟子实体可分为菌盖、菌体、菌托三大部分，对竹荪的研究集中在其可食用的菌体部分，而对占子实体鲜重一半以上的菌托研究较少，且主要分析菌托的营养物质［15-17］。檀东飞等［18］研究发现棘托竹荪菌托挥发油和石油醚提取物均有抑菌作用，并采用GC-MS 进行分析，但未明确抑菌物质的具体成分。因此，本文以棘托竹荪菌托为研究对象，以金色葡萄球菌为指示菌，提取菌托中的抑菌活性物质，采用色谱法进行分离纯化、GC-MS 分析分离得到的活性组分，以期探明菌托抑菌物质的主要成分，为利用竹荪菌托资源，开发竹荪天然防腐剂提供依据。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

棘托竹荪(Dictyophora.echinovolvata)，采自福建顺昌。

指示菌:金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，枯草芽孢杆菌Bacillus subilis，大肠杆菌Escherichia coli，蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus，标准摩根氏菌Morganella Fulton，肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis。以上菌种由福建省疾病预防控制中心提供。

1.2 仪器试剂

1.2.1 主要仪器

N-1100 旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司);GHP-9080 隔水式恒温培养箱(上海一恒科技有限公司);中压液相制备色谱系仪(Buchi，Pump Manager C-615，Pump Module C-605，RI DETECTOR，UV Photometer C-635);Agilent HP6890-5973N 气质联用仪。

1.2.2 试剂

石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、氯仿等试剂均为分析纯，中国医药(集团)上海化学试剂公司产品。

2 实验方法

2.1 抑菌物质的提取

取50 g 棘托竹荪菌托干样，破碎，过60 目筛，置于500 mL 具塞三角瓶，分别加入石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇4 种提取试剂各250 mL，超声波震荡1 h，静置过夜后过滤，5000 rpm 离心10 min，上清液用旋转蒸发仪在50 ℃下真空浓缩至恒重，称量(m)，用5 mL 原提取剂溶解，获得粗提物，检测抑菌活性，选择最佳试剂的粗提物进行下一步实验。

提取率(%)=m/50×100

2.2 棘托竹荪菌托粗提物抑菌活性测定

棘托竹荪菌托乙酸乙酯提取物(Ethyl acetate extract，EAE)用少量甲醇溶解后，定量吸取梯度体积，110 ℃完全烘干，称量，确定浓度并稀释至20 mg/mL，以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、标准摩根氏菌为指示菌，滤纸片法(d=5 mm)和打孔法(d=8 mm)比较各处理液的抑菌活性，以pH4.0，浓度为20 mg/mL 的山梨酸钾溶液作为阳性对照，甲醇溶液为空白对照。

2.3 抑菌物质粗提物理化性质

2.3.1 抑菌物质耐热性能测定

棘托竹荪菌托乙酸乙酯提取物用少量的甲醇溶解后稀释至5 mg/mL，等量装入小试管，然后分别在100 ℃水浴中分别加热10、20、30、40、50、60、70 min，自然冷却后，以甲醇为对照，打孔法(d=8 mm)每孔加样0.3 mL，比较各处理液对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。

2.3.2 抑菌物质抗紫外辐射耐性测定

棘托竹荪菌托乙酸乙酯提取物用少量的甲醇溶解后稀释至5 mg/mL，等量装入培养皿中，在无菌间15 W 紫外灯下，距离25 cm，照射15、30、45、60、75min，以甲醇为对照，打孔法(d=8 mm)每孔加样0.3 mL，比较各处理液对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。

2.4 棘托竹荪菌托抑菌物质的提取、分离

2.4.1 棘托竹荪菌托乙酸乙酯提取物制备

1000 g 棘托竹荪菌托干品剪碎，过60 目筛，加4000 mL 乙酸乙酯，置室温下(25～30 ℃)浸提48 h(不时摇动)。400 目过滤，滤液低温4 ℃、5000 rpm离心5 min，收集提取液。滤渣再加乙酸乙酯2000 mL 摇匀浸提24 h，过滤、离心(条件同上)。合并两次提取液，50 ℃减压薄膜浓缩至恒重，-18 ℃保存备用。

2.4.2 棘托竹荪菌托抑菌物质的分离

2.4.2.1 硅胶柱层析

固定相按提取物(g)∶硅胶(g)=1∶50 称取硅胶(200～300 目)，根据硅胶量选择适当的层析柱;流动相选择氯仿-甲醇洗脱体系或石油醚-乙酸乙酯洗脱体系。每2 倍保留体积收集于三角瓶中，每个梯度洗脱10 倍保留体积。50 ℃下旋转蒸发仪浓缩干，用甲醇或氯仿溶解后移至小烧杯中。薄层层析(TLC)法检测合并相同组分。

2.4.2.2 反相中压液相制备色谱分离层析

固定相为YMC-GEL，流动相选择不同比例的甲醇-水梯度洗脱，流速5 mL/min，最大压力为3 MPa;馏分收集器为1 管/5 min，每梯度收集10 管，50 ℃下旋转蒸发仪浓缩干，用甲醇或氯仿溶解后移至小烧杯中。薄层层析(TLC)法检测合并相同组分。

2.5 抑菌活性成分GC-MS 分析

气相色谱条件:进样口温度为250 ℃，检测器温度为280 ℃。柱温采用程序升温方式:70 ℃3 min，3 ℃/min 至100 ℃，100 ℃6 min，5 ℃/min 至150℃，150 ℃6 min，10 ℃/min 至250 ℃，250 ℃15min，分流比30∶1，柱流量1.2 mL/min，柱头压5.5psi。进样量1.0 μL。

质谱条件:用70 eV 的EI 源230 ℃，四级杆150℃，溶剂延迟时间为3 min 分子量范围为25～500 amu。

通过计算机检索与NIST 质谱库和Wiley 质谱库提供的标准质谱图进行对照，并参照已发表的质谱图，从而鉴定;同时将相对百分含量按峰面积归一化法计算，根据色谱图保留峰面积计算各成分的相对百分含量。

2.6 数据统计分析

试验结果采用SPSS16.0 统计软件，one-way ANOVA 进行方差分析，均值比较用LSD 和Duncan法。

3 结果与分析

3.1 不同试剂对抑菌物质提取效果

从图1 和表1 可以看出，5 种试剂提取物抑菌能力依次为甲醇＞乙酸乙酯＞丙酮＞正丁醇＞石油醚。从表1 可以看出甲醇提取时的得率最高，为7.81%，用5 mL 原提取试剂重新溶解后甲醇提取物浓度是乙酸乙酯提取物7.8 倍左右，但抑菌能力的增加并不明显，说明用甲醇提取时杂质相对较多，不利于分离抑菌活性物质，从分离效率的角度考虑选用乙酸乙酯作为提取试剂。

图1 不同试剂提取物抑菌效果(指示菌:金黄色葡萄球菌)Fig.1 The antibacterial ability of different extracts(indicator bacteria:Staphylococcus aureus)

表1 不同试剂提取物抑菌效果Table 1 The antibacterial ability of different extracts

3.2 粗提物抑菌活性测定

菌托乙酸乙酯提取物抗菌活性测定实验结果如图2 所示。提取物对6 种常见的细菌均有抑制作用，其抑菌效果依次为金黄色葡萄球菌＞标准摩根氏菌＞枯草芽孢杆菌＞蜡样芽孢杆和＞大肠杆菌＞肠炎沙门氏菌。提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最佳，因此选择金黄色葡萄球菌作为下一步分离实验中检测分离组分抑菌活性的指示菌。

图2 乙酸乙酯提取物抑菌试验Fig.2 The antibacterial ability of ethyl acetate extract against different indicator bacteria

3.3 提取物中抑菌成分的理化性质研究

3.3.1 抑菌成分热稳定性试验

菌托乙酸乙酯提取物100 ℃沸水浴中处理不同时间后进行抑菌试验，以甲醇作为对照，结果如图3所示，可以看出提取物在100 ℃沸水浴70 min 过程中，其抑菌能力并未有较大的改变，说明提取物中的抑菌成分具有较好的热稳定性。

图3 不同热处理时间对提取物抑菌能力的影响Fig.3 Effect of heat treatment on antibacterial activity of the ethyl acetate extract

3.3.2 UV 对抑菌成分稳定性的影响

菌托乙酸乙酯提取物经紫外线照射后的抑菌活性如图4 所示，实验表明抑菌活性物质在紫外灯照射15～75 min 过程中抑菌能力变化不明显，说明菌托乙酸乙酯提取物中的抑菌活性物质不受紫外照射的影响或者影响很小。

图4 UV 对提取物抑菌能力的影响Fig.4 Effect of UV on antibacterial activity of the ethyl acetate extract

3.4 棘托竹荪菌托抑菌物质分离、纯化

3.4.1 乙酸乙酯提取物初次分离结果(氯仿-甲醇洗脱)

乙酸乙酯提取物初次分离共获得40 个组分(编号CM1-CM40)，其中洗脱组分CM15-CM18、CM34-CM37 对大肠杆菌有抑制作用。洗脱组分CM14-CM24、CM26-CM29、CM31-CM37 对金黄色葡萄球菌均有抑菌作用。根据TLC 结果将CM14-CM24 合并为组分DEV①，CM26-CM29 合并为DEV②，CM31-CM37 合并为DEV③。

表2 洗脱组分的抑菌效果Table 2 Antibacterial activity of different components after preliminary purification

从表2 可以看出，菌托乙酸乙酯提取物经过硅胶柱层析后分离得到的3 个具有抑菌作用的组分DEV①、DEV②、DEV③，其中DEV①与DEV③对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用，且抑菌效果较强;而DEV②只对金黄色葡萄球菌有较弱抑制作用。3 个组分是以不同极性洗脱相洗脱出来，其中DEV①和DEV③洗脱极性相差较大，说明DEV①和DEV③是含不同抑菌化合物的组分，由此可以推测竹荪菌托抑菌成分中至少含有两个以上具有抑菌活性的化合物。

3.4.2 DEV①硅胶柱分离层析结果

称取300 mg 分离下来的组分DEV①进行层析柱(石油醚-乙酸乙酯洗脱)，获得组分经TLC 分析后合并为DEV①-1～DEV①-11。从图5 可以看出，组分DEV①-5～DEV①-10 均有抑菌作用，随着洗脱剂极性增加抑菌作用减弱;将抑菌组分DEV①-5～DEV①-9 合并，待挥发干后继续进行柱层析(氯仿-甲醇洗脱)，通过薄层层析结果将各个组分合并为10 个组分(1 号-10 号)，测定抑菌作用，如图6 所示7 号和8 号有抑菌活性，合并为DEVⅠ。

图5 DEV①分离组分抑菌检测(石油醚-乙酸乙酯洗脱)(1-11:DEV①-1-DEV①-11)Fig.5 Antibacterial activity of different components separated from DEV①(Eluent:petroleum ether-ethyl acetate;1-11:DEV①-1-DEV①-11)

图6 DEV①二次分离组分抑菌检测(氯仿-甲醇洗脱)(1-10:1 号-10 号)Fig.6 Antibacterial activity of different components further separatd from DEV①(Eluent:chloroform-methanol;1-10:No.1-No.10)

3.4.3 抑菌组分DEV③中抑菌成分的分离纯化

称取500 mg 分离下来的组分DEV③进行反相中压液相制备色谱分离层析，获得组分经TLC 分析后合并为DEV③-1～DEV③-30。从图7 可以看出，组分DEV③-1 和DEV③-4～DEV③-8 均有抑菌作用。将抑菌组分DEV③-4～ DEV③-8 合并为DEVⅡ。

图7 DEV③分离组分抑菌检测Fig.7 Antibacterial activity of different components separated from DEV③

3.5 抑菌活性成分GC-MS 分析

3.5.1 DEV I 化学成分分析

对DEV I GC-MS 分析结果共鉴定出57 种成分，其中相对含量在1%以上共20 个，如表3 所示。其中脂类12 种，醇类1 种，酸类4 种，其他3 种。20种成分相对含量共占总体的82.07%。

表3 DEVⅠ中相对含量1%以上的化学成分Table 3 The components with relative content more than 1% of total in DEV I

3.5.2 DEVⅡ化学成分分析

对DEVⅡGC-MS 分析结果共鉴定出24 种成分，其中相对含量在1%以上共6 个，如表4 所示。6 种成分相对含量共占总体的86.2%，其中相对含量较高的为肉桂酸和2-呋喃甲酸，二者均为已知具有抑菌作用的物质，因此推测为DEVⅡ具有抑菌作用的主要功能成分。

表4 DEVⅡ中相对含量1%以上的化学成分Table 4 The components with relative content more than 1% of total in DEVⅡ

4 讨论与结论

实验发现竹荪菌托提取物具有抑菌作用，且具有较广的抑菌菌谱、热稳定、耐紫外照射的特点。菌托作为竹荪生产过程产生的废弃物，开发成本低，从菌托中开发获得天然防腐剂具有巨大的潜在价值。

竹荪被发现具有抑菌作用已有较多报道。长裙竹荪提取液对细菌、病原菌具有广泛的抑制作用，在中性至碱性条件下可发挥抑菌作用，对高温、高压稳定，但对酵母菌、霉菌没有明显的抑制作用［5，9，18］;棘托竹荪挥发油对霉菌、酵母及细菌都有抑菌效果［10-14，19］，水提物对常见有害菌具有一定的抑菌效果，对高温有一定的稳定性［7］，可见竹荪中的抑菌成分与竹荪种类及提取方法有关，这也说明了竹荪中具有多种的抑菌成分，如有报道竹荪多糖具有抑菌活性［20-21］。

檀东飞等［19］采用非极性至极性的5 种溶剂浸提棘托竹荪中的抑菌物质，结果表明随着溶剂极性的增强，提取得率增大;同时对不同溶剂提取物分别做了抑菌试验，提取物的抑菌效果是:乙酸乙酯提取物＞正己烷提取物＞丙酮提取物＞乙醇提取物＞水提取物，这与本文对棘托竹荪菌托的实验结果相近。本文通过活性追踪法分离纯化棘托竹荪菌托乙酸乙酯提取物的抑菌成分，虽然未能得到单一抑菌成分，但是极性较大的抑菌组分DEVⅡ中肉桂酸及2-呋喃甲酸的相对含量接近80%，而二者均为已知具有抑菌活性的化学物质［22-24］，因此可以推测棘托竹荪菌托乙酸乙酯提取物起抑菌作用的主要物质为肉桂酸及2-呋喃甲酸。分别采用液相色谱法和气象色谱法测得竹荪菌托乙酸乙酯粗提物中肉桂酸含量为0.0153%，2-呋喃甲酸含量为0.0086%。分离获得的极性较小的组分DEVⅠ中相对含量超过1% 的占82.07%，而相对含量超过3% 的占59.52%，但这些已知物质中未见报道具有明显的抑菌作用成分，由此认为DEVⅠ抑菌作用可能是多种小极性化合物协同作用的结果。Huang MQ 等［25］从长裙竹荪子实体挥发性成分中分离鉴定一种抗生素Albaflavenone，并通过定量分析出长裙竹荪中Albaflavenone 含量为0.0063%，推测该化合物是长裙竹荪具有抑菌活性的主要活性成分;黄明泉同时也在棘托竹荪子实体和棘托竹荪蛋的挥发性成分中检测发现Albaflavenone［26］，棘托竹荪菌托中是否含有该成分，以及其他相关的抑菌活性物质和不同化学组分的比列对抑菌活性的影响还有待进一步研究。

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