枯草芽胞杆菌B13液体发酵培养条件的优化

肖嫩群，曾 奥，成 壮，龚力民

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙410208；2.湖南省微生物研究院，湖南 长沙410009）

枯草芽胞杆菌B13液体发酵培养条件的优化

肖嫩群1，曾 奥2，成 壮1，龚力民1

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙410208；2.湖南省微生物研究院，湖南 长沙410009）

枯草芽胞杆菌B13是一种良好的微生态制剂原材料，为了增加枯草芽胞杆菌B13的芽孢产量，研究采用单因素试验对接种量、培养时间、机械搅拌程度、装液量和消泡剂添加量等发酵条件进行了优化。结果表明，接种量0.5%，发酵液中添加4根玻璃棒和0.4%的豆油，装液量为容器的1/10，37℃下以200 r/Mi n的转速振荡培养8～48 h，可获得较高浓度的菌体。

芽胞杆菌B13；液体发酵；培养条件

芽胞杆菌是一种抗逆性强、易于保存的工业生产用菌，同时具有产酶、抗菌、降解养分等多重功效[1-4]。土壤是芽胞杆菌的主要栖息场所，从土壤中分离芽胞杆菌是一条重要途径。课题组于2004年从土壤中分离了一株芽胞杆菌，命名为B13。经初步验证，该菌可有效分解有机磷和无机磷，并对黄曲霉和烟草青枯病菌有拮抗作用。在此基础上，对该菌株进行了生化和分子生物学鉴定，确定其为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）[5]。在培养基和土壤中进行解磷解钾试验，结果表明该菌在培养基和土壤中均能分解无机磷和有机磷；通过白菜盆栽和田间小区试验对该菌株的功效进行评价，结果表明该菌株可提高白菜的产量和品质，并对土壤理化性状有一定的改良作用[6]。综上所述，枯草芽胞杆菌B13具有非常好的应用前景。因此，研究优化枯草芽胞杆菌B13的液体发酵条件，以期为该菌株的进一步开发应用提供数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试菌株 枯草芽胞杆菌B13，由课题组分离、筛选，能够分解无机磷和有机磷，同时对烟草青枯病菌和黄曲霉具有明显的抑制作用。

1.1.2 培养基 （1）菌种保存斜面培养基：牛肉膏蛋白胨斜面[7]。（2）种子液培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，水1 000ML，pH值7.0～7.2。（3）最佳培养基成分为：红糖1%，麸皮1%，豆粕粉0.5%，尿素为1%，磷酸氢二钾0.5%，水1 000ML，pH值7.0～7.2。

1.2 实验方法

1.2.1 最佳接种量确定 按0.5%、1%、2%、4%、8%的接种量分别进行发酵，37℃摇床（200 r/Min）中振荡培养48 h，在波长为660 nm的分光光度计上测其菌液OD值。每个处理重复3次，根据OD660值确定最佳接种量。

1.2.2 枯草芽胞杆菌B13的生长曲线 接种量为1%，培养条件同1.2.1，分别于培养0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h后取样测菌液的OD660值，绘制枯草芽胞杆菌的生长曲线，以确定最佳培养时间。

1.2.3 机械搅拌对枯草芽胞杆菌生长的影响 在发酵三角瓶中分别加入0、1、2、4根2 cm长的玻棒，接种量为1%，培养条件同1.2.1，每个处理重复3次，根据OD660值判断机械搅拌强度对供试菌生长的影响。

1.2.4 装液量对枯草芽胞杆菌生长的影响 在250 ML三角瓶中分别装入25、50、75、100ML培养基，灭菌后按1%接种量接种，培养条件同1.2.1，培养48 h后测其菌液OD660值，每个处理重复3次。

1.2.5 消泡剂对枯草芽胞杆菌生长的影响 在150 ML三角瓶中装入50ML培养基，分别加入0、0.1%、0.2%、0.4%的植物油，接种量为1%，培养条件同1.2.1，培养48 h后测其菌液OD660值，每个处理重复3次。

2 结果与分析

2.1 最佳接种量

由图1可知，随着接种量的增加，枯草芽胞杆菌B13的OD660值表现出先降低后增加的趋势；其中，接种量为4.0%时，OD660值最低，仅0.076；而接种量为0.5%时，OD660值最高，为0.657；接种量在0.5%～4.0%的范围内，接种量与菌体产量呈负相关，接种量为4.0%～8.0%范围内，接种量与菌体产量呈正相关；平均OD660值由大到小排列依次为：0.5%＞1%＞8%＞2%＞4%。由此可知，枯草芽胞杆菌B13的最佳接种量为0.5%。

图1 接种量对枯草芽胞杆菌B13生长的影响

2.2 枯草芽胞杆菌B13的生长曲线

从图2中可以看出，枯草芽胞杆菌B13培养8 h后开始迅速增殖，至48 h发酵液OD660值达到最高，之后开始缓慢下降。由此推断，8～48 h为枯草芽胞杆菌B13的最佳生长期。

2.3 机械搅拌对枯草芽胞杆菌B13生长影响

在发酵液中分别加入0～4根玻璃棒，已达到机械搅拌的目的。从图3中可以看出，玻璃棒数量越多，枯草芽胞杆菌B13生长越好，生物量越大；其中，添加4根玻璃棒的处理，搅拌效果最好，其OD660值是未添加玻璃棒处理的11.3倍。这说明机械搅拌可显著提高菌体量，其原因可能是机械搅拌能够保障发酵液中的通气量，从而促进菌体进行有氧呼吸，提高菌体产量。需要注意的是，并不是玻璃棒越多越好，机械搅拌过强容易损伤菌体，不利于菌体生长。

图2 枯草芽胞杆菌B13的生长曲线

图3 机械搅拌对枯草芽胞杆菌B13生长的影响

2.4 装液量对枯草芽胞杆菌B13生长的影响

在250ML三角瓶中分别装入25、50、75和100 ML培养液，接入1%的种子液，培养48 h后菌液OD660值分别为1.445、1.077、0.932和0.818。很明显可以看出，菌体浓度随着装液量的增加而减少，以每瓶25ML的装液量，菌体浓度最高。这也可证实了，通气环境越好，对于芽胞杆菌B13这种好氧菌的生长越有利。但是在实际生产过程中，1/10的装液量会导致整体产量降低、发酵液过度挥发、容器利用率低等问题，不利于节省生产成本和创造较高经济效益。

2.5 消泡剂对芽胞杆菌生长的影响

消泡剂的主要作用是消除发酵过程中产生的泡沫，避免逃液和染菌，保证发酵正常进行。发酵过程中常用的消泡剂为动植物油脂和一些化学合成的高分子化合物。该研究选用豆油作为消泡剂，在发酵液中分别添加0、0.1%、0.2%和0.4%的豆油，接入1%的种子液，培养48 h后菌液OD660值分别为0.739、0.844、1.135和1.405。这表明，在试验设计的消泡剂添加量范围中，豆油添加量与菌体浓度呈正相关关系，豆油最适添加量为0.4%。

3 讨论

通过对枯草芽胞杆菌B13发酵条件的优化，确定其最佳发酵条件为：接种量0.5%；菌体最适生长时期为8～48 h；在发酵液中放置4根玻璃棒，增加通气量；装液量为容器的1/10；豆油添加量为0.4%；37℃下以200 r/Min的转速振荡培养。

枯草芽胞杆菌B13是一种良好的微生态制剂原材料[8]，要将菌体制成生物产品，进行工业化生产，就必须确定其最佳发酵条件。该试验在实验室内对芽胞杆菌液体发酵条件进行优化，目的就是为其应用推广提供基础资料，有效降低生产成本。

恶劣环境下，一个细菌产生一个芽孢，条件适宜时重新成为一个细菌，数量没有增加，因此芽孢不是细菌的繁殖体，而是一种休眠体，这对细菌的工业化应用意义重大。不同细菌其芽孢产生的时期不同。但大多数细菌的芽孢是在生长稳定后期产生，这个时期营养物质大量消耗，加上代谢产物的增加，条件不适宜细菌生长。因此，芽孢也是一种自我保护措施。但也有报道称某些细菌可能在生长前期就产生芽孢[9]，这可能与细菌个体的DNA有关的；同时，也有研究表明菌株形成芽孢与所需的供氧条件相关[10-11]，这可能与氧气对芽孢形成影响的内在机理有关；如何提高枯草芽胞杆菌B13发酵过程中芽孢的产量，有待于进一步研究。

[1]谭周进，周清明，肖启明，等.芽胞杆菌B13功能的初步研究[J].微生物学通报，2005，32（5）：103-106.

[2]洪 斌，刘晓桥，陈红漫.枯草芽孢杆菌防治植物真菌病害研究进展[J].上海农业学报，2006，22（1）：109-112.

[3]王 强，彭开松，严 兵，等.枯草芽孢杆菌源抗生素研究进展[J].动物医学进展，2010，31（9）：97-101.

[4]肖嫩群，谢果珍，龚力民，等.芽胞杆菌B13液体发酵培养基的优化[J].中国微生态学杂志，2014，26（8）：883-886.

[5]周 静，黄晓辉，肖冰梅，等.一株多功能芽孢杆菌的鉴定[J].中国微生态学杂志，2013，25（9）：997-1000.

[6]肖嫩群，黄晓辉，胡汝晓，等.芽胞杆菌B13对白菜产量和品质的影响[J].中国微生态学杂志，2014，26（1）：27-30，33.

[7]赵 斌，何绍江.微生物学实验[M].北京：科学出版社，2002.115-208.

[8] 肖嫩群，谢果珍，龚力民，等.芽胞杆菌B13解养分效果研究[J].中国微生态学杂志，2014，26（7）：764-766.

[9] KwakJW，KimKS，DeweyDY.ProductionofRosamicin：Improvement of synthdtic medium [J]. Applied and Enviromental Microbiology，1983，45（1）：350-353.

[10]王瑞霞.枯草芽孢杆菌B-903菌株的发酵条件及所产生抗生素的研究[D].郑州：河南农业大学，2005.

[11]荆卓琼.枯草芽孢杆菌B2发酵工艺及其复配研究[D].兰州：甘肃农业大学，2009.

（责任编辑：成 平）

OptiMization of Liquid Fermentation MediuMfor Bacillus B13

XIAONen-qun1，ZENG Ao2，CHENG Zhuang1，GONG Li-Min1
（1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,PRC;2.Hunan Institute of Microbiology,Changsha 410009,PRC）

Bacillus 13 is a favorable micro-ecological preparation.In order to improve the spore yield of Bacillus 13,the culture conditionsof Bacillussubtilis B13wereoptimized by single factorexperiments to investigate the effectof different inoculum,culture time, mechanicalagitation,liquid volume and defoamer additive.Results showed that the optiMized fermentation processwas as follows：The fermentation was carried out in vessel with ten percent liquid,0.5%seed culture,the optimuMbacteria age was 8～48 hours,glass rod number formechanicalagitationwas four,and incubated at37℃,220 r/Min.

Bacillus B13;liquid fermentation;culture condition

Q939.9

A

1006-060X（2015）04-0095-02

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.04.030

2014-04-21

湖南省科技厅项目（2014S K3016）

肖嫩群（1975-），女，湖南宁乡县人，实验师，主要从事微生物生态学以及中药材栽培等研究。

成 壮