湖南桃江病圃稻瘟病病菌遗传多样性的SS R分析

毛 锐，任佐华，刘 翔，倪兰凤，周 瑚，戴良英，刘二明

（1.湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128；2．植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

湖南桃江病圃稻瘟病病菌遗传多样性的SS R分析

毛 锐1,2，任佐华1,2，刘 翔1,2，倪兰凤1,2，周 瑚1,2，戴良英1,2，刘二明1,2

（1.湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128；2．植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

为了解湖南桃江病圃稻瘟病病菌遗传多样性，选用14对SS R引物，采用SS R标记技术分析了从该病圃中丽江新团黑谷（广谱高感稻瘟病品种）上分离的89个稻瘟病菌单孢菌株的遗传多样性。结果表明，以相似系数0.72为界，将89个菌株划分成20个遗传谱系，其中L06和L07为优势宗谱，分别含有18和13个菌株，各占总菌株数的20.2%和14.6%；有6个宗谱分别含4～7个菌株，共占总菌株数的34.8%，另12个宗谱分别含菌株1～3个，共占总菌株数的30.3%。该病圃中的稻瘟病菌群体复杂，遗传多样性丰富，湖南抗瘟品种选育和品种布局应针对L06和L07优势宗谱。

病圃；稻瘟病菌；SS R；遗传多样性

稻瘟病是由Magnaporthe oryzae引起的一种重要的气流传播的灾害性水稻真菌病害[1]，它严重影响水稻高产稳产，在发病严重的年份，减产在10%～50%，全球每年因稻瘟病导致水稻减产在11%～30%[2]。选育并种植抗病品种，是公认最直接有效的防治措施之一，但由于田间稻瘟病菌群体组织结构复杂，易变性或因无毒基因突变导致抗病品种在推广3～5 a后抗病性丧失[3]，其引发病害的流行给生产带来极大的危害[4]。因此，明确一个水稻种植区域的稻瘟病菌群体遗传结构，对抗瘟水稻育种材料的发掘及抗瘟品种的利用和布局有重要的实践意义。

近年来，SSR分子标记广泛运用于抗稻瘟病遗传多样性的研究。谭清群等[5]对32份抗瘟病地方种质资源进行SSR遗传多样性分析，确立亲缘关系的远近与其地理来源有一定的相关性。涂敏等[6]用24对SSR引物对云南省160个水稻品种进行遗传多样性分析，证实云南省水稻品种的群体遗传多样性越高，群体对稻瘟病的抗性水平越高。李小湘等[7]用SSR分子标记方法对湖南不同来源地方种质136份材料进行分析，评价了湖南同（近）名地方稻的遗传差异程度，为同（近）名地方稻种质资源的保存，供种以及重点利用种质遴选提供理论依据。前人对稻瘟病病圃遗传多样性的SSR分析主要集中于国内各区域性之间，而对湖南桃江地域性稻瘟病病圃系统研究较少，本研究利用SSR分子标记方法分析了2013年湖南桃江稻瘟病菌群体遗传多样性，旨在揭示该地区稻瘟病菌遗传多样性特征，为以后湖南水稻瘟品种的选育及抗瘟品种的利用提供必要的基础。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

供试菌株89个，是于2013年采自湖南桃江病圃感病品种丽江新团黑谷（LTH）上采集的叶瘟感病样本，利用体式显微镜单孢分离法获得89个单孢菌体。

1.2 菌株培养和DNA提取

将纯化后的供试菌株菌丝接种到稻瘟病菌液体培养基中（葡萄糖20 g、酵母浸出液5 g、CaCl20.1 g、 KH2PO40.5 g、K2HPO40.5g、MgSO40.5g、水1000mL），于28℃、180 r/Min摇床上培养4～6 d，收集聚集成球的菌丝体，采用EasyPureGenomic DNA Kit试剂盒提取稻瘟病菌基因组DNA，并使用NanoDrop的Spectrophotometer检测DNA浓度，调整到150 ng/uL，备用。

1.3 SSR引物

14对引物：KMS02、KMS20、SMS17、A5、D4、D5、G5、FG01、FG02、FG03、MS355、MS363、MS677、C3，引物由上海introgen公司合成（表1）。

1.4 PCR扩增体系及电泳

表1 14对SSR引物

PCR扩增反应体系的总体积为25μL，体系中含有正、反引物各1.25μL，11.5ML去离子水，10μL 2× Taq PCRMasterMix，1μL模板DNA。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性30 s。55～57℃（按特定引物设定）退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min后4℃保存取扩增产物5 uL加Loading Buffer进行上样，在2%琼脂糖凝胶电泳检测，电压110 V，35min，电泳完后在凝胶成像系统下观察、拍照并记录。

1.5 数据处理与分析

根据微卫星引物扩增结果，运用Quantity One软件进行分析处理，建立SSR的0-1数据库，将电泳谱带的有无转换成二进制，有亮带即为1，无亮带即为0。用DPS数据处理系统的Nei&Li方法进行计算遗传距离，运用最长距离进行宗谱归类。

2 结果与分析

2.1 供试菌株的PCR扩增

14对SSR引物对89个供试菌株进行了有效扩增，不同引物扩增不同的供试菌株呈现均有不同。KMS02、KMS20、C3、A5、G5、D4、D5、SMS17、FG01、FG02、FG03、MS355、MS363、MS677分别扩增出112、128、130、143、147、134、212、154、82、133、79、128、88和72条亮带，充分体现出89个稻瘟病菌株的多态性，复杂性。代表性扩增结果如图1所示。

2.2 桃江病圃稻瘟病菌群体的遗传组成

图1 引物MS363对部分供试菌株的扩增（M为D N A分子量标准；76～103为供试菌株）

89个供试稻瘟病菌株在0.72的相似系数下被划分为20个遗传宗谱，其中优势宗谱是L06和L07，分别含有18和13个菌株，各占总菌株数的20.2%和14.6%，有6个宗谱分别含4～7个菌株，共占总菌株数的34.8%。另12个宗谱分别含菌株1～3个，共占总菌株数的30.3%；具体聚类分析结果见表2。

表2 0.72相似系数下89个供试菌株的遗传宗谱

3 小结与讨论

稻瘟病是危害水稻最严重的真菌病害之一，在水稻新品种推广3～5 a后会因田间稻瘟病菌种群的小种变异而丧失抗性成为感病品种，因此及时准确地了解田间稻瘟病菌群体的变化趋势尤为重要[8-10]。

本研究表明2013年湖南桃江稻瘟病圃中的稻瘟病群体结果相对复杂，遗传多样性明显。虞选杰等[11]应用13对引物对2012年湖南桃江采集分离的100个稻瘟病菌菌株进行PCR扩增，并依据扩增反应结果，对供试稻瘟病菌群体进行聚类分析，将100个稻瘟病菌菌体划分为24个遗传宗谱。而本研究于2013年在湖南桃江采集分离得到的89个稻瘟病菌菌体被分为20个遗传宗谱，其遗传宗谱未发生较大的变化，这说明该病圃稻瘟病菌群体在一定的时期内相对较稳定。因此，该病圃作为国家和湖南水稻品种抗稻瘟病鉴定点是合适的。

SSR分子标记技术，不仅具有共性好，重复性好，多态性高，扩增结果稳定，而且能准确建立SSR的0-1数据库，并计算出遗传宗谱。本试验结合历年对湖南稻瘟病遗传结构的研究，初步揭示了LTH上的稻瘟病菌与湖南各稻区栽种品种上的稻瘟病菌在遗传结构上的相似性，且遗传宗谱更丰富，遗传多样性更复杂，可为全面了解湖南地区稻瘟病变化趋势，以及抗病育种和利用遗传多样性控制稻瘟病的危害与流行提供理论依据。

[1]邓其明，周 鹏，林 琳，等.水稻稻瘟病抗性基因研究进展及其在育种上的应用[J].安徽农业科学，2009，37（4）：1489-1492，1508．

[2] 李 亚，刘二明，戴良英，等.湖南稻瘟病菌群体遗传多样性与病菌致病型的关系[J].中国水稻科学，2007，21（3）：304-308.

[3] 王 静，李彦泉.水稻稻瘟病综合防治技术[J].吉林农业，2012，（6）：69．

[4] 穆慧敏，姜 华，王艳丽，等.研究稻瘟病菌群体遗传多态性的分子标记方法[J].中国水稻科学，2013，27（5）：545-552.

[5] 谭清群，杨学辉，何海永，等.32份水稻抗稻瘟病材料的SS R遗传多样性分析[J].西南农业学报，2012，25（2）：479-484.

[6] 涂 敏，王云月，卢宝荣，等.云南省水稻品种稻瘟病抗性差异与遗传多样性相关研究[J].湖北农业学报，2011，50（6）：1149-1152.

[8]李小湘，肖军治，段永红，等.湖南同名地方稻资源SS R标记及表现型的比较分析[J].植物遗传资源学报，2014.，15（2）：248-254.

[9]刘二明，刘志贤，魏 林，等.湖南两类稻瘟病生态系病菌群体遗传多样性研究[J].湖南农业大学学报（自然科学版），2003，29（3）：211-215．

[10]黄国庆，郭加沅，肖国樱.SS R标记在水稻遗传育种中的应用[J].江西农业学报，2007，19（4）：20-22.

[11]虞选杰，任佐华，管玲莉，等.湖南桃江病圃丽江新团黑谷上稻瘟病菌遗传多样性分析[J].杂交水稻，2014，29（3）：70-73.

（责任编辑：卢红玲）

Analysis of Genetic Diversity of Magnaporthe oryzae in Rice Blast Nursery in Taojiang of Hunan by SSR Markers

MAORui1,2，REN Zuo-hua1,2，LIU Xiang1,2，NILan-feng1,2，ZHOU Hu1,2，DAILiang-ying1,2，LIU Er-Ming1,2
（1.College of Plant Protection,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,PRC;2.Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests,Changsha 410128,PRC）

To explore the genetic diversity of Magnaporthe oryzae in rice blastnursery in Taojiang,Hunan,89 single spore isolates of Magnaporthe oryzae isolated froMhighly broad spectruMsusceptible blast variety,Lijiangxintuan were analysed by the SSR technology w ith the14 pairsof primers.The results showed that these isolateswere classified into 20 genetic lineages at the0.72 siMilar level,among which L06 and L07,including 18 and 13 isolates,respectively,accounting for 20.2%and 14.6%of the total isolates,were the dominant lineages,while there were 4～7 isolates accounting for 34.8%of the total isolates in the another 6 lineages,and hold 1～3 isolates accounting for 30.3%of the total isolates in the other 12 lineages.Therefore,it suggested that the blast nursery possessed constituent complex of M.oryzae population and rich genetic diversity.Atpresent,breeding of resistantto riceblast for Hunanmay beagainst L06 and L07 lineages.

blastnursery;Magnaporthe oryzae;SSR;genetic diversity

S435.11.41

A

1006-060X（2015）04-0035-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.04.013

2015-03-20

公益性行业（农业） （201203014）；湖南省自然科学基金青年项目（12JJ4028）

毛 锐（1990-），男，湖南长沙市人，硕士研究生，研究方向为微生物与植物分子互作。

刘二明