越鞠丸对代谢综合征模型大鼠的治疗作用及其对肝脏AMPK-α表达的影响

杨红莲 张 丽 段玉红

（陕西中医学院附属医院，陕西咸阳712000）

越鞠丸对代谢综合征模型大鼠的治疗作用及其对肝脏AMPK-α表达的影响

杨红莲 张 丽 段玉红

（陕西中医学院附属医院，陕西咸阳712000）

目的：研究越鞠丸对代谢综合征大鼠肝脏-磷酸腺苷激活的蛋白激酶-α（AMPK-α）表达的影响。方法：大鼠随机分为正常对照组、模型组、越鞠丸大剂量组、越鞠丸小剂量组、二甲双胍组，除正常对照组以外，其余各组用高脂饲料诱导代谢综合征大鼠模型，8周后各药物组分别灌胃相应药物，正常对照组和模型组给予等量生理盐水，连续灌胃4周。观察并比较各组大鼠体重、血压与空腹血糖、血脂水平和肝脏AMPK表达。结果：与正常对照组比较，模型组大鼠体重、血压、空腹血糖、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）水平明显升高（P＜0.05），肝脏磷酸化AMPK-α（P-AMPK-α）表达水平明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，越鞠丸组大鼠血压、空腹血糖、TG、TC、LDL-C明显降低（P＜0.05，P＜0.01），P-AMPK-α蛋白表达明显升高（P＜0.05）。结论：越鞠丸能改善代谢综合征大鼠代谢紊乱症候群，其上调P-AMPK-α蛋白的表达是其可能的作用机制。

越鞠丸 代谢综合征 肝AMPK-α 血脂 SD大鼠

代谢综合征（MS）是多种代谢成分异常聚集的病理状态，是一组复杂的代谢紊乱症候群。本病病因病机尚不明确，目前多数学者认为能量代谢失衡是MS的主要病因[1]。磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）是调节全身能量平衡的关键因素，不仅可以在细胞水平作为能量感受器，还可以通过激素和细胞因子来参与调节机体的能量代谢[2-4]，提示AMPK有可能在预防机体发生代谢性疾病中起重要作用[5]。中医认为，“郁”是MS的核心病机，并且贯穿其病理变化的始终，对其发生发展均有影响。越鞠丸能行气解郁，主治各种因素导致的郁，其所治病症与MS十分吻合。目前临床已将越鞠丸广泛应用于治疗肥胖、高血压病、糖尿病等疾病，均取得了较好的疗效[6-9]。本研究试图以AMPK为切入点研究越鞠丸治疗MS的机理，从而为临床上提供药效机理明确的治疗药物。

1 实验材料

1.1 动物 SD雄性大鼠，体重（160±8）g，由第四军医大学实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK军2013-009号。

1.2 试剂 GLU检测试剂盒（批号512051），TG检测试剂盒 （批号506051），TC检测试剂盒 （批号0707031），HDL-C和 LDL-C试 剂 盒 （批 号0707041、0707042），均为北京利德曼生化技术有限公司产品。PVDF膜（MilliPore，USA），Rabbit Anti-AMPK Polyelonal Antibody（Cell Signaling，USA），Rabbit Anti-PhosPhor-AMPK Polyclonal Antibody（Cell Signaling，USA）。

1.3 仪器 贝克曼CX4型全自动生化分析仪，电子天平，沈阳龙腾电子有限公司生产。TDL-5型高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂生产。大鼠动脉血压测量仪，正华生物仪器设备有限公司生产。

1.4 药物 越鞠丸 （北京同仁堂制药有限公司，批号:131016），用万能粉碎机粉碎，每次称取110g用生理盐水配置成0.42g/mL，置于冰箱4℃保存，用时温水加热至常温，小剂量稀释成0.21g/mL。盐酸二甲双胍片，深圳市中联制药有限公司生产，批号: 1201060。

2 实验方法

2.1 造模与分组、给药 随机将大鼠分为正常对照组及造模组，正常对照组给予饲料+自来水喂养，造模组给予高盐高脂饲料（普通饲料63%，猪油20%，蛋黄5%，食用盐10%，胆固醇2%）+30%的果糖水喂养，造模共8周。8周后以大鼠体重、尾动脉收缩压、空腹血糖、血脂水平（TG、TC、LDL-C和HDL-C）为观察指标，确定造模成功。造模成功的大鼠随机分为模型组、二甲双胍组（0.15g/kg）和越鞠丸大、小剂量组（4.2g/kg和2.1g/kg），每组10只。分组后，正常对照组继续给予大鼠饲料+自来水，其余各组大鼠给予高盐高脂饲料+30%果糖水。同时各药物组按照1mL/100g灌胃给予相应药物，正常对照组和模型组给予等量生理盐水，连续灌胃4周。

2.2 血清、肝组织收集 各组大鼠于末次给药后，禁食不禁水 12h，3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（0.1mL/100g），腹主动脉取血，取血后迅速摘取肝脏，动脉血液室温静置20min，4℃，3500r/min离心10min，分离血清，分装冻存于-80℃冰箱以备检测生化指标。收集肝脏，滤纸吸干，分装于冻存管中，做好标记迅速置于液氮罐中以备提取蛋白质。

2.3 大鼠MS相关指标测定 麻醉取血前，称量各组动物体重，测量大鼠尾动脉血压。用全自动生化分析仪检测大鼠血清空腹血糖、血脂水平。

2.4 肝脏组织AMPK-α、磷酸化 AMPK-α（PAMPK-α）蛋白测定 从液氮中取出约100mg肝脏组织，充分裂解，4℃、12000g×5min离心，吸取上清，采用BCA法测定肝脏组织的蛋白含量。制备8%SDSPAGE凝胶，进行电泳，转膜，染色，封闭。用抗AMPK-α抗体（1∶1000）、抗P-AMPK（Thr172）抗体、抗GAPDH抗体 （1∶3000）4℃孵育过夜；TBS-T洗涤PVDF膜3次×5min，分别用对应辣根过氧化物酶标记二抗 （1∶5000），室温孵育lh；TBS-T洗涤PVDF膜3次×5min，滤纸吸干水分，加上发光液，于暗室曝光，在X光片上显影。Western blot结果使用光密度测量仪扫描，使用Quantity One分析软件进行灰度值比较。

2.5 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行数据处理，数据采用（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 治疗后各组大鼠体重、血压及血糖比较 与正常对照组比较，模型组大鼠体重、血压、空腹血糖均明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，越鞠丸大剂量组大鼠血压明显降低（P＜0.05）；越鞠丸大、小剂量组及二甲双胍组空腹血糖水平明显降低（P＜0.05）。越鞠丸大、小剂量组大鼠体重、血压、空腹血糖与二甲双胍组比较无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠体重、血压及空腹血糖比较（±s）

表1 各组大鼠体重、血压及空腹血糖比较（±s）

注：与正常对照组比较，△P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

组别 动物数（只）体重（g）血压（mmHg）空腹血糖（mmol/L）正常对照组10306.7±22.85100.1±8.19 5.49±0.71模型组 10 328.4±21.42△109.5±9.08△6.31±0.78△二甲双胍组 10 312.6±17.20 105.2±7.77 5.43±0.87*越鞠丸大剂量组 10 309.7±20.67 100.6±9.49*5.48±0.77*越鞠丸小剂量组 10 315.0±24.17 106.5±12.5 5.51±0.88*

3.2 治疗后各组大鼠血脂指标比较 与正常对照组比较，模型组大鼠甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白-胆固醇 （LDL-C）水平均明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，越鞠丸大剂量组大鼠TG、TC、LDL-C水平明显降低（P＜0.05，P＜0.01），越鞠丸小剂量组TG、TC水平明显降低（P＜0.05），二甲双胍组TC、LDL-C水平明显降低（P＜0.05）。越鞠丸大、小剂量组各血脂指标与二甲双胍组比较均无统计学差异（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血脂指标比较（±s） mmol/L

表2 各组大鼠血脂指标比较（±s） mmol/L

注：与正常对照组比较，△P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别TC HDL-C正常对照组动物数（只） TG LDL-C 1.49±0.29 1.03±0.17 10 1.32±0.50 0.6±0.14 1.82±0.28△0.95±0.19二甲双胍组 10 1.36±0.51 1.51±0.30*0.85±0.12 0.62±0.12*越鞠丸大剂量组 10 1.31±0.56*1.29±0.39**0.91±0.18 0.63±0.09*越鞠丸小剂量组 10 1.26±0.52*1.45±0.33*0.86±0.16 0.68±0.11模型组 10 1.80±0.43△0.73±0.11△

3.3 治疗后各组大鼠肝脏AMPK-α和P-AMPK-α蛋白水平比较 与正常对照组比较，模型组大鼠PAMPK-α表达水平显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，越鞠丸大、小剂量组P-AMPK-α表达水平明显升高（P＜0.05）。越鞠丸大、小剂量组AMPK-α、PAMPK-α表达水平与二甲双胍组比较无统计学差异（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠肝脏AMPK-α和P-AMPK-α表达比较（±s）

表3 各组大鼠肝脏AMPK-α和P-AMPK-α表达比较（±s）

注：与正常对照组比较，△P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

组别 动物数（只） AMPK-α P-AMPK-α正常对照组10 0.92±0.17 0.94±0.22模型组 10 0.82±0.19 0.73±0.15△二甲双胍组 10 1.00±0.25 0.88±0.18越鞠丸大剂量组 10 0.93±0.14 0.92±0.16*越鞠丸小剂量组 10 0.99±0.24 0.89±0.16*

4 讨论

中医学认为素体肥胖，或饮食不节，嗜食肥甘厚味，损伤脾胃，酿生痰湿，阻滞气机，化瘀阻络，致使MS成为以痰、瘀、热为标，脾肾亏虚、肝阳偏亢为本的顽证，故认为气郁、血郁、痰郁、火郁、湿郁、食郁是导致MS的主要病机。上述论述恰恰与朱丹溪“六郁”理论相一致。越鞠丸是朱丹溪根据“六郁”之说创立的方剂，方名“越鞠”具发越鞠郁之气的涵义，主治气、血、痰、火、湿、食等郁，由苍术、香附、川芎、神曲、栀子五药组成。香附行气解郁，以治气郁，为君药；苍术燥湿运脾，以治湿郁；川芎活血化瘀，以治血郁；栀子清热泻火，以治火郁；神曲消食导滞，以治食郁。五味中药可分别针对MS早期诸邪进行协同干预。我们选用二甲双胍作为阳性对照药，主要因为目前研究表明二甲双胍对MS具有全面的调节作用，除了具有降糖、增强胰岛素敏感性、改善脂代谢紊乱、降低血压等作用外[10-11]，还可以增加大鼠AMPK-α的表达及活性[12-13]。

2005年国际糖尿病联盟（IDF）颁布的人MS诊断标准，即在中心型肥胖基础上，伴有胰岛素抵抗或空腹血糖受损/糖耐量异常、高血压、低HDL和高LDL血症等其中两项者，判定为MS。动物MS成模与否亦参考上述标准，其中是否符合中心型肥胖指标主要通过测量大鼠体重和腹围判定。本实验结果显示，与正常对照组比较，模型组大鼠体重、血压、空腹血糖及血清TG、TC、LDL-C水平均显著升高，且估测模型组大鼠腹围大于正常对照组，提示造模成功。与模型组比较，越鞠丸大、小剂量可不同程度降低上述指标，表明越鞠丸对MS具有一定的治疗作用。

AMPK是近年发现的一种调节机体糖、脂肪和蛋白质代谢的重要蛋白分子。研究表明，当AMP/ATP的比值升高时，AMPK可磷酸化激活大量的下游靶分子，从而减少ATP的利用，增加ATP的产生，使细胞的分解代谢增加，反之则细胞合成代谢增加。在哺乳动物中，AMPK的组成包括α、β、γ三个亚单位，是一个三聚体结构。其中α亚单位起催化作用，而β和γ亚单位起调节作用。α亚单位的数个位点均可被磷酸化，其中苏氨酸172位点及其磷酸化对AMPK活性的调节起重要作用[14]。研究中所检测的总AMPK及活性AMPK蛋白通常是指其α亚单位。实验结果显示，与正常对照组比较，模型组肝组织P-AMPK-α蛋白表达水平明显下降；与模型组比较，越鞠丸大、小剂量组P-AMPK-α表达水平均明显升高，表明越鞠丸对P-AMPK-α蛋白表达水平具有一定的干预作用。

近年来，诸多医者虽有使用越鞠丸治疗MS并取得比较满意的临床效果，然而至今尚未有学者能够阐明越鞠丸治疗MS的作用机制。此次实验结果表明，越鞠丸各剂量组可不同程度降低MS大鼠血压、空腹血糖、血脂水平，增加MS大鼠肝脏组织P-AMPK-α蛋白表达，故初步推测越鞠丸通过激活AMPK防治MS的发生发展。课题组下一步将围绕AMPK及其信号通路深入研究越鞠丸治疗MS的作用机理，从而为临床防治MS提供药效显著、作用机理明确的有效中药。

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R589.905

A

1672-397X（2015）05-0077-03

杨红莲（1980—），女，药学博士，副主任药师，研究方向：防治代谢性疾病的中药研究。465134440@qq.com

2014-12-12

编辑：吴 宁

陕西省教育厅科学研究项目计划（12JK1030）