通莲Ⅰ号方抑制小鼠食管癌移植瘤生长作用及其机制研究

张艳丽 贾永森 赵 刃 包巨太

（1.迁安燕山医院，河北迁安064400；2.河北联合大学中医学院，河北唐山063000；3.唐山市中医医院，河北唐山063000）

通莲Ⅰ号方抑制小鼠食管癌移植瘤生长作用及其机制研究

张艳丽1贾永森2赵 刃3包巨太2

（1.迁安燕山医院，河北迁安064400；2.河北联合大学中医学院，河北唐山063000；3.唐山市中医医院，河北唐山063000）

目的：研究通莲I号方对食管癌Eca109细胞荷瘤小鼠的抑瘤作用及其对肿瘤组织免疫因子TNF-α、IL-6和IL-8的影响。方法：食管癌Eca109细胞接种于小鼠右前肢皮下。小鼠随机分为模型组和通莲I号方低、中、高剂量组，分别灌胃生理盐水和通莲I号方各剂量。各组连续给药3周，末次给药结束3周后分离小鼠瘤组织，计算抑瘤率，ELISA法检测肿瘤组织上清液TNF-α、IL-6和IL-8含量。结果：通莲I号方高剂量组瘤重明显低于模型组（P＜0.05），抑瘤率明显高于通莲I号方低剂量组（P＜0.05）。HE染色可见，通莲I号方高剂量组的肿瘤细胞淡染，核分裂较少，可见较多肿瘤细胞肿胀变性坏死。通莲I号方高剂量组肿瘤组织TNF-α、IL-6和IL-8表达明显低于模型组与通莲I号方中、低剂量组（P＜0.05，P＜0.01）。结论：通莲I号方可抑制小鼠食管癌Eca109细胞移植瘤生长，其抑瘤机制与下调瘤组织TNF-α、IL-6和IL-8等因子水平，增强免疫调节有关。

通莲I号方 食管癌 Eca109细胞 荷瘤小鼠 肿瘤坏死因子-α 白介素-6 白介素-8 病理学

食管癌属于中医“噎膈”范畴，病机多为气滞、痰阻和血瘀阻滞食道，造成津伤血枯，食管干涩，饮食难下。有报道显示，中国男、女食管癌发病率和死亡率均居全球第1位[1]。本研究组创制活血行气复方——“通莲I号方”治疗食管癌获得了较好的临床疗效，并已获得国家专利[2]。前期研究表明，该方可调节细胞周期抑制食管癌细胞增殖[3]，其抑癌分子机制与下调核因子kappa B（NF-κB）信号通路蛋白表达有关[4]。本研究通过荷瘤小鼠体内实验，进一步观察了通莲I号方对食管癌移植瘤的抑制作用以及对免疫因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）和白介素8（IL-8）的影响。

1 实验材料

1.1 动物 4～5周龄昆明小鼠，雌、雄各半，体质量20～25g，清洁级，购于中国食品药品检定研究院，合格证号：SCXK（京）2009-0017。

1.2 细胞株 食管癌Eca109细胞，购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。

1.3 药物 通莲I号方（桃仁、红花、升麻、槟榔、半枝莲、白花蛇舌草，剂量比为2∶1∶1∶1∶3∶3），各单味药物均购于唐山市中医医院中药房，由河北联合大学中医学院中心实验室中药制剂室制备，提取液含生药材1.8g/mL。按人与小鼠换算比计算出高、中、低剂量（生药量浓度分别为1500、750、375mg/L），以生理盐水（NS）配成。

1.4 试剂 新生小牛血清（GIBCO公司），DMEM培养基（GIBCO公司），胰蛋白酶（GIBCO公司）；噻唑蓝（MTT，Amresco公司），二甲基亚砜（DMSO，Amresco公司），IL-6、IL-8和TNF-α酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（YYES BIOTECH公司），以上试剂均购自北京科海荣京生物科技公司。

1.5 仪器 1100型无菌超净台 （FORMA公司），3336型CO2培养箱 （FORMA公司），NOVAPATH 450酶标光度计 （Bio-Tek公司），TMD-2倒置式显微镜（NIKON公司），3MK型低温高速离心机（SIGMA公司），JJ-2型组织匀浆机（Waring公司）。

2 实验方法

2.1 分组与给药 小鼠随机分为4组，分别为模型组和通莲 I号方高、中、低剂量组。将 Eca109细胞以 1×107/mL的浓度接种于小鼠右前肢皮下，2周后成模（剔除瘤体过大或过小者）。模型组灌胃NS 10mL/kg；通莲I号方高、中、低剂量组分别灌胃 1500、750、375mg/L中药液，给药量均为10mL/kg。各组均连续给药3周，再继续饲养3周后将小鼠颈椎脱臼处死，检测相关指标。

2.2 抑瘤率 各组小鼠处死后，取肿瘤组织于电子天平上称取瘤重，按照如下公式计算抑瘤率：

抑瘤率=（模型组平均瘤重－给药组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%

2.3 形态学观察 取部分剥离的瘤组织以10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，制成4μm厚的切片，HE染色，光镜下观察瘤组织细胞形态。

2.4 ELISA法检测移植瘤瘤体组织上清液中TNF-α、IL-6和IL-8蛋白表达 荷瘤小鼠瘤体组织取材，取样约100mg，加入1mL生理盐水研磨，6000r/min离心15min，取上清液。在标准品孔及待测样本孔中分别加入50μL酶联亲和物，37℃温育60min，反复冲洗，排除水分。分别加入显色液A、B各50μL，室温下避光反应15min。加入终止液50μL，终止反应。检测不同浓度TNF-α、IL-6和IL-8标准品及各组瘤体组织上清液样本。记录上清液在450nm处的光密度值（OD），根据OD值计算各指标含量。

2.5 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，组间差别显著性检验采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组平均瘤重及药物抑瘤率比较 通莲I号方高剂量组瘤重较小，与模型组比较有显著性差异（P<0.05）。通莲I号方各剂量组抑瘤率比较，高剂量组抑瘤率明显高于低剂量组（P<0.05）。见表1。

表1 各组小鼠平均瘤重及药物抑瘤率（±s）

表1 各组小鼠平均瘤重及药物抑瘤率（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与通莲I号方低剂量组比较，#P＜0.05。

组别 动物数（只）模型组 10通莲I号方高剂量组 10通莲I号方中剂量组 10通莲I号方低剂量组 10瘤重（g） 抑瘤率（%）3.57±1.05 1.51±0.49*# 61.04±4.79# 2.28±0.87 41.39±3.08 3.05±1.29 22.56±2.74

3.2 各组小鼠皮下移植瘤组织形态学观察 模型组瘤组织内肿瘤细胞核仁深染，腺体拥挤，血窦丰富；通莲I号方高剂量组肿瘤细胞淡染，核分裂较少，可见较多肿瘤细胞肿胀变性坏死；通莲I号方中、低剂量组肿瘤细胞多数深染，可见少量坏死区，但整体结构与模型组相似。见图1。

3.3 各组肿瘤组织上清液TNF-α、IL-6和IL-8含量比较 与模型组比较，通莲I号方高剂量组TNF-α、IL-6和IL-8明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。通莲I号方各剂量组组间比较，高剂量组各指标明显高于中、低剂量组（P＜0.05）。见表2。

图1 各组小鼠皮下移植瘤组织形态学病理切片（×200）

表2 各组小鼠移植瘤瘤体组织TNF-α、IL-6和IL-8含量（±s） pg/mL

表2 各组小鼠移植瘤瘤体组织TNF-α、IL-6和IL-8含量（±s） pg/mL

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与通莲I号方中剂量组比较，▲P＜0.05；与通莲I号方低剂量组比较，#P＜0.05。

组别 动物数（只）IL-8 TNF-α IL-6模型组 10264.48±23.55通莲I号方高剂量 10通莲I号方中剂量 10通莲I号方低剂量 10 123.30±17.64 187.67±19.80 61.82±14.43**▲# 120.49±15.61*▲# 104.56±13.58 179.12±17.54 108.78±16.32 185.35±20.79 181.09±29.51*▲# 263.66±31.49 278.15±26.34

4 讨论

通莲I号方专为食管癌气滞血瘀、热毒内结而设。方中半枝莲和白花蛇舌草清热解毒，解除体内之瘀毒；升麻升清，槟榔下行，一升一降，胃气乃通；桃仁和红花活血行气。全方重在活血行气、解毒散结。本研究结果表明，通莲I号方高剂量组小鼠瘤体生长受到显著抑制，抑瘤率达到60%左右，瘤重明显低于模型组和通莲I号方低剂量组 （P＜0.05），可见高剂量组抑瘤作用显著；而通莲I号方中、低剂量组抑瘤率与模型组比较无统计学差异。

组织形态学HE染色结果显示，通莲I号方高剂量组与模型组比较，瘤体组织结构改变较明显，瘤组织内有大片坏死区；中、低剂量组瘤体切片中央虽然也有散在坏死区，但面积较小，深染部分占绝大多数视野，与模型组相似。表明高剂量的通莲I号方可促进瘤体组织坏死，对肿瘤生长有明显抑制作用。

免疫调节在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用。TNF-α是由巨噬细胞/单核细胞活化产生的一种细胞因子，在炎症反应、细胞免疫和肿瘤免疫中发挥关键作用，局部高浓度的TNF-α具有抗肿瘤活性[5]。IL-6具有多种生物学活性，可以调节其他多种因子的作用，其主要通过调控细胞周期相关基因，促进肿瘤血管生成，促进肿瘤局部炎症反应和肿瘤肝细胞自我更新等多种机制促进肿瘤发生、发展[6]。IL-8是由巨噬细胞和上皮细胞等分泌的白介素亚类细胞因子，它可以通过刺激血管生成直接促进肿瘤生长，较高水平的IL-8与肿瘤患者体重减轻、恶病质形成有直接关系[7]。

本研究结果显示，模型组小鼠TNF-α水平最高，这和许多同类研究报道一致。本研究观察到较高浓度的TNF-α出现在核仁深染、腺体拥挤、血窦丰富的模型组，这提示食管癌的TNF-α表达水平与肿瘤细胞活性呈正相关。而经高剂量通莲I号方干预的小鼠肿瘤组织中TNF-α水平显著降低，与模型组比较有极显著性差异（P＜0.01）。模型组小鼠IL-6和IL-8含量最高，而通莲I号方高剂量组显著下降，与模型组比较有显著性差异（P＜0.05）。通莲I号方中、低剂量组的上述三项指标变化甚微，与模型组比较无显著性差异；各剂量组间比较，高剂量组与中、低剂量组显示出显著性差异（P＜0.05）。本研究从免疫调节角度证明了高剂量的通莲I号方抑制食管癌的部分机制。

综上，通莲I号方有较好的抑制食管癌荷瘤小鼠瘤体生长作用，通过诱导肿瘤组织坏死，下调肿瘤组织TNF-α、IL-6和IL-8等免疫因子水平，发挥免疫调节作用。需要指出的是，多靶点作用是中药复方抗癌的优势，本研究仅从宏观瘤体变化、组织形态学和若干免疫因子差异等方面做了探讨，其是否涉及与免疫调节相关的分子信号通路或者基因表达的变化等，值得进一步深入探讨。

[1] Wang L，Tang W，Chen S，et al.N-acetyltransferase 2 Polymorphisms and Risk of Esophageal Cancer in a Chinese Population.PloS One，2014，9（2）：877

[2] 河北联合大学.治疗食管癌的活血行气中药制剂及其制备方法：中国，ZL201110308544.0[P].2013-4-10[2014-11-15]

[3] 贾永森，李继安，韩炳生，等.通莲Ⅰ号方及其拆方对食管癌Eca109细胞增殖及细胞周期的影响.中国实验方剂学杂志，2012，18（12）：191

[4] 贾永森，李继安，杜宁，等.通莲Ⅰ号方对食管癌Eca109细胞 NF-κB信号通路影响的研究.时珍国医国药，2012，23（10）：2534

[5] 纪勇，陈静瑜，郑明峰，等.茶树菇多糖联合化疗对食管癌大鼠TNF-α和IFN-γ的影响.肠外与肠内营养，2012，19（5）：293

[6] 陈德玉，金丽艳，朱龙萍，等.let-7a和IL-6在食管鳞状细胞癌组织中的表达及两者的相关性.细胞与分子免疫学杂志，2013，29（11）：1181

[7] 陈瀚文，王健.IL-8/R在胃癌中的作用及机制研究进展.免疫学杂志，2013，29（5）：447

R735.1 文献标识码 A 文章编号 1672-397X（2015）04-0075-03

河北省自然科学基金（H2013209053）；河北省中医药管理局科研计划项目（2014185）

张艳丽（1980-），女，医学硕士，主治医师，从事中医内科临床研究工作。

贾永森，医学博士，副教授。jysen@163. com

2014-11-15

吴 宁