聚磷菌—JN459的分离和聚磷特性研究

钟传青，姜天翼，王静，张春明

（山东建筑大学市政与环境工程学院，山东 济南250101）

0 引言

增强型生物除磷工艺EBPR（enhanced biological phosphorus removal）是目前普遍使用的生物除磷技术，除磷效率是普通生物除磷工艺的3～7倍［1－3］。EBPR工艺的基本原理为聚磷菌 PAOs（phosphate accumulation organisms）在厌氧／好氧交替环境中进行放磷和过量吸磷过程，然后通过排放污泥进行除磷。在厌氧阶段 PAOs吸收挥发性脂肪酸 VFAs（volatile fatty acids）转化为细胞内碳源 PHA（poly-βhydroxyalkanoates）并储存起来；在好氧阶段PAOs分解PHA，获得的能量用于细胞生长和过量摄取磷元素，并以多聚磷酸盐 Poly-P（Polyphosphate）的形式蓄积，最终活性污泥的含磷量可大于10%［4－7］。

PAOs是一类微生物的总称，主要包括不动杆菌属、红环菌属、气单胞菌属、棒杆菌属、肠球菌属、葡萄球菌属和放线菌纲等，还没有证据证明哪类PAOs在 EBPR系统中占主导地位［8－10］。传统定义的PAOs要求微生物具有两个特征：（1）厌氧阶段合成聚羟基烷PHAs（Poly-hydroxy-alkanoates）和好氧阶段合成Poly-P；（2）厌氧和好氧阶段交替过程中有Poly-P和PHAs相互的转换。已有研究表明并不是所有聚磷微生物都有Poly-P和PHAs循环，目前对PAOs的定义更倾向于“一切能够超过自身生长所需过量吸收磷的微生物”［11］。因此，阐明 PAOs种类、聚磷特性及各菌株在EBPR系统中的地位一直是生物除磷研究的重要方向。

文章从高新区污水处理厂活性污泥中分离到一株聚磷菌JN459，对其微生物学分类地位进行了鉴定，同时研究了该菌株在纯培养条件下的聚磷特性，研究结果可为深入研究Microlunatus phosphovorus（M.phosphovous）聚磷代谢的分子调控机制提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源

活性污泥来自济南市高新区污水处理厂。

1.2 污水水质

市政污水来自济南市高新区污水处理厂的进水，水质参数有：化学需氧量（COD）为 247 mg／L，氨态氮（NH4＋-N）为 63.3 mg／L，磷酸根（PO34-P）为13.5 mg／L。

人工合成污水成分为：葡萄糖为0.3 g、蛋白胨为 0.1 g、酵母粉为0.01 g、醋酸钠为 0.15 g、氯化铵为 0.2 g、氯化钠为 0.05 g、磷酸氢二钾为 0.1 g、硫酸镁为0.12 g、纯化水为1 L。实测NH＋4-N为65.1 mg／L，PO3－4-P为14.2 mg／L。

1.3 SBR反应器

10 L体积的实验室序列间歇式SBR（sequencing batch reactor）反应器（由小型发酵罐改装），具备在线灭菌、在线温度控制、在线pH检测与溶解氧DO（Dissolved oxygen）检测、空气与氮气流量控制等功能。

1.4 菌株的分离与筛选

取10 mL的活性污泥样品，用40 mL的磷酸盐溶液（5 mg／L的三聚磷酸钠和8.5 g／L的氯化钠）稀释后均质，梯度稀释后涂布到 R2YA培养基（0.5 g的酵母粉、0.5 g的蛋白胨、0.5 g的酪蛋白氨基酸、0.5 g的葡萄糖、0.5 g的可溶性淀粉、0.3 g的丙酸钠、0.3 g的磷酸氢二钾、0.03 g的硫酸镁、20 g的琼脂粉和1 L的纯化水），在25℃温度下培养，挑取单菌落。菌株形态、异染颗粒染色和生理生化特征测定根据文献进行［12－13］。

1.5 16SrDNA分析

用LB液体培养基培养JN459菌株，提取该菌株总DNA，用高保真DNA聚合酶链式反应PCR（polymerase chain reaction）扩增其16SrDNA。将PCR产物连接到中间载体进行DNA测序，并将测序结果在GenBank中进行Blast比对，并与GenBank／EMBL／DDBJ中已知序列进行同源性分析。

1.6 菌株纯培养和磷吸收试验

将JN459株液体培养至对数生长期，离心收集菌体，并用无菌水洗涤，然后接种到SBR反应器中。吸磷和放磷试验采用好氧－缺氧工艺，pH值控制为7.0，每个循环过程中好氧时间为2 h，溶解氧浓度约为4 mg／L；缺氧时间为2 h，用N2置换体系中O2，维持溶解氧浓度低于0.2 mg／L；最后，静置时间为2 h，整个工艺维持约2 d，无菌体沉降和出水过程。每30 min取样检测水相中磷含量，每个试验方案重复三次，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 JN459菌株的生理生化特征

通过单菌分离和纯培养技术从活性污泥中分离得到一株球菌，编号为JN459。该菌最适生长温度为25～30℃，最高耐受温度40℃，最低生长温度5℃；最适生长的pH值为7，最低的生长pH值为4，最高生长的 pH值为 9。JN459菌体直径约1.5μm，显微镜观察可见单个或2～4个菌体聚集，无运动性，革兰氏染色阳性，亚甲基蓝染色可见由Poly-P构成的异染颗粒。JN459为兼性好氧菌，过氧化氢酶呈阳性，但氧化酶活性较弱，在无氧条件下可以将硝酸盐还原为亚硝酸盐，不能利用亚硝酸盐。JN459可以利用的碳源包括淀粉、L—山梨糖、D—阿拉伯糖、甘油、甘露醇、乙酸和丝氨酸，不能利用乳糖、丙酸、苹果酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺，结果见表1。

表1 JN459的生理生化特征

2.2 菌株JN459的16 S rDNA鉴定

16 S rDNA序列测序结果显示，JN459菌株16 S rDNA的 PCR扩增片段长度为 1444 bp，与M.phosphovorus NM-1菌株的16 S rDNA仅有2个碱基不同，相似度达到 99.8%。JN459菌株 16 S rDNA的同源性分析如图1所示。综合其形态特征和生理生化鉴定试验结果，确定JN459菌株为M.phosphovorus。M.phosphovorus是 1995年从EBPR系统分离得到的聚磷菌，具有显著的聚磷效果，Poly-P可以达到其菌体干重的10%，荧光标记原位杂交技术 FISH（fluorescence in situ hybridization）分析结果显示 M.phosphovorus占EBPR总 菌 群 2.7%，占 PAOs 9%［14－15］。但 是M.phosphovorus在厌氧阶段无明显释磷现象，与其它PAOs好氧吸磷和厌氧释磷的特点有显著差异，提示M.phosphovorus在磷代谢途径上存在独特的调控机制。

图1 基于JN459 16 S rDNA序列同源性的系统发育树图

2.3 JN459的聚磷特性

用SBR检测好氧－缺氧工艺条件下JN459的吸磷和放磷曲线如图2所示。由图2可以看出，以人工合成污水为进水时，JN459在好氧阶段摄取体系中大部分可溶性磷，除磷率可达93.7%，该结果与文献中 M.phosphovorus的除磷效果相近［8］。在市政污水体系中JN459的除磷率为84.4%，这可能与市政污水中碳源成分比较复杂，不适合JN459菌株生长代谢有关。在缺氧阶段初期，体系中溶解磷没有明显回升趋势，说明JN459不具有PAOs可以大量分解PHA并释放可溶性磷以维持菌株生长的显著特征。当维持缺氧状态至180 min时，人工污水和市政污水体系中溶解磷都小幅上升，在240 min时可溶性磷分别是缺氧阶段初始值（120 min）的1.6和2.0倍。，说明 JN459可以分解 Poly-P并获取能量，但相关酶系与转运体系可能需要诱导并且表达水平较低［15－16］。

3 结论

通过本研究可知：

图2 SBR工艺中JN459磷的吸收与释放图

（1）从市政污水处理厂活性污泥中分离到一株聚磷菌JN459，该菌株在好氧条件下可生成Poly-P的异染颗粒，经生理生化实验及16 S rDNA分析，将JN459菌株鉴定为M.phosphovorus。M.phosphovorus是一种革兰氏阳性球菌，在好氧条件下能够积累Poly-P，而在厌氧阶段通过分解Poly-P提供能量帮助细菌吸收有机物，M.phosphovorus不能合成糖原，因此Poly-P是厌氧阶段能量的唯一来源，这与典型的PAOs不同。

（2）好氧条件下M.phosphovorus JN459菌株的除磷率达到93.7%，在缺氧条件下初期无明显的Poly-P分解现象，经过较长时间的诱导后溶解磷含量会上升，说明磷代谢的酶系与转运体系是可诱导的，该结果有助于深入研究M.phosphovorus JN459聚磷代谢的分子调控机制，为将其更好地应用到EBPR系统提供理论基础。

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