UPLC-MRM-MS 法测定头花蓼药材中7 个指标成分

刘 跃，胡 杰，谢玉敏，黄 勇，廖尚高，郑 林

1贵阳医学院 药学院 贵州省药物制剂重点实验室;2 贵阳医学院 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵阳 550004

头花蓼又名四季红、石莽草等，为蓼科植物头花蓼Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don 的干燥全草或地上部分，在《苗族医药学》、《中华本草·苗药卷》、《贵州植物志》、2003 版《贵州省中药、民族药质量标准》中均有收载，现广泛用于治疗泌尿系统感染，泌尿系统结石，急、慢性尿道炎等泌尿系统疾病［1］。目前，以头花蓼为原料药已开发并上市了热淋清颗粒、宁泌泰胶囊、四季草颗粒等各种单复方苗药制剂。据文献报道，头花蓼的化学成分主要包括挥发油、黄酮类及酚酸类等化合物［2-6］，其药理活性研究表明，其内含有的酚酸及黄酮类具有一定的抗氧化活性，为头花蓼的主要药效成分［7-9］。

2003 版《贵州省中药、民族药质量标准》中仅收录用高效液相法测定槲皮素这一单一成分，尽管目前已有不少学者对头花蓼当中的没食子酸、槲皮苷及槲皮素等成分进行了含量测定［10，11］，以多指标成分对头花蓼药材进行全面质量评价尚未报道。基于此，本文以没食子酸、原儿茶酸、杨梅苷、陆地棉苷、槲皮苷、槲皮素-3-O-(2″-没食子酰基)-鼠李糖苷、槲皮素及儿茶素这7 个成分为检测指标，应用专属性强，灵敏度高，快速准确的UPLC-MRM-MS 法对头花蓼药材进行全面的含量测定，进一步为头花蓼及其相关制剂质量评价及其资源的综合开发、利用提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

葛根素对照品(中国食品药品检定研究院，批号0752-9605，纯度≥98%)，没食子酸(中国固体制剂制造技术国家工程研究中心，批号M20-101209，纯度≥98%)，原儿茶酸、杨梅苷(四川省维克奇生物科技有限公司，批号110306，111018，纯度≥98%)，陆地棉苷、槲皮苷、槲皮素-3-O-(2″-没食子酰基)-鼠李糖苷、槲皮素及儿茶素实验室自制(采用1H NMR、13C NMR、MS、UV、IR 波谱进行结构鉴定，用UPLC-PDA 在多个检测波长下测定，其峰面积归一化结果均大于98)，甲醇(天津科密欧化学试剂有限公司)、乙腈(德国Merck 公司)为色谱纯，其余溶剂均为分析纯，水为超纯水。头花蓼药材:共6 批样品，来源于贵州施秉头花蓼GAP 基地及贵州主要产地，由贵阳医学院龙庆德副教授鉴定为蓼科植物头花蓼Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don的干燥全草。

1.2 仪器设备

ACQUITY 系统超高液相色谱-三重四级杆串联质谱仪(美国Waters 公司，包括二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、三重四级杆质谱分析器和Masslynx4.1 质谱工作站)。

2 实验方法

2.1 标准溶液的配制

对照品溶液:精密称取没食子酸等7 种对照品适量，分别置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。得没食子酸(1.073 mg/mL)、原儿茶酸(0.974 mg/mL)、陆地棉苷(0.690 mg/mL)、槲皮苷(1.020 mg/mL)、儿茶素(0.902 mg/mL)、槲皮素-3-O-(2″-没食子酰基)-鼠李糖苷(0.540 mg/mL)及槲皮素(1.010 mg/mL)的对照品储备液。分别精密量取没食子酸等七种对照品储备液适量，用甲醇按梯度稀释成所需浓度，得混合系列标准溶液。置冰箱(-20 ℃)保存，备用。

内标溶液:精密称取葛根素10.33 mg，用甲醇定容至25 mL，获得葛根素0.413 mg/mL 的储备液。取内标储备液适量至5 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20 μg/mL 的内标溶液，置冰箱(-20℃)保存，备用。

2.2 供试品溶液的制备

取本品细粉约0.5000 g，精密称定，置50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)混合液25 mL，称定重量(精确至0.01 g)，置水浴中加热回流1 h，放冷，称重，用提取液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液5 mL 至25 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件

色谱柱:Waters BEH C18(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)柱，保护柱:Waters Van Guard BEH C18(2.1 mm×5 mm，1.7 μm);流速:0.35 mL/min;柱温:45 ℃;进样体积为1 μL;流动相:0.1% 甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B);梯度洗脱程序如下:0～1.5 min，5%～30%(A);1.5～3 min，30%～90%;3～4 min，90%;4～5 min，90%～5%。

2.4 质谱条件

采用电喷雾电离源(ESI)，毛细管电离电压3 kV，离子源温度120 ℃;去溶剂气N2，流速650 L/h，去溶剂气温度350 ℃;碰撞气Ar，流速0.16 mL/min。扫描方式为多反应离子监测(MRM)，监测离子见表2。

表1 多反应离子检测质谱条件Table 1 MRM analysis parameters for the 7 targeted compounds

注:分析物1～7 分别为没食子酸、原儿茶酸、陆地棉苷、槲皮苷、儿茶素、槲皮素-3-O-(2″-没食子酰基)-鼠李糖苷及槲皮素.Note:Analyte 1-7 are gallic acid，protocatechuic acid，que-3-O-β-D-Glc，quercitrin，catechin，que-3-O-(2″-O-galloyl)-β-D-Glc and quercetin，respectively.

3 实验结果

3.1 专属性试验

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液适量并分别加入内标(葛根素)溶液，15000 rpm 离心5 min，取上清液分别进样，结果见图1。由此结果可看出成分间分离良好，未见杂质干扰，供试品溶液中被测成分与7 个对照品的保留时间相同，通过比较被测定成分和对照品的母离子、子离子质谱图，两者一致，表明本法专属性良好。

图1 混合对照品溶液(A)和供试品溶液(B)的UPLC-MRM-MS 图谱Fig.1 UPLC-MRM-MS chromatogram of reference substances (A)and sample (B)

3.2 线性试验

精密吸取“2.1”项下制备的混合对照品溶液适量，依次稀释，制得6 个浓度的系列浓度线性工作液，分别进样测定。以待测物的峰面积与内标峰面积之比(A/Ai)为纵坐标Y，各物质浓度(C)为横坐标X 进行直线回归，权重系数为1/X，求得直线方程，即为标准曲线。回归方程见表2。

表2 7 种成分的线性关系Table 2 Linear relationships of 7 components

3.3 重复性试验

取同批次头花蓼药材，按“2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在UPLC-MRM-MS 条件下分别进样测定，根据内标法计算没食子酸、原儿茶酸、陆地棉苷、槲皮苷、儿茶素、槲皮素-3-O-(2″-没食子酰基)-鼠李糖苷及槲皮素的平均含量分别为1.276、0.179、0.041、1.326、0.069、0.061 及2.681 mg/g，RSD 分别为1.07%、3.58%、1.43%、2.23%、2.62%、2.62%及2.59%，结果表明此方法重复性良好。

3.4 精密度试验

取同一份供试品溶液，在相同条件下连续测定3 d，每天进样6 次，根据内标法计算含量，结果7 种成分的日内和日间精密度(n=6)分别为0.92%～3.49%和1.21～4.41%，表明仪器精密度良好。

3.5 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别处理后于0、2、4、8、12、18、24 h 进样分析，7 种成分的RSD 分别为1.03%、2.66%、1.83%、0.93%、2.95%、2.73%、3.23%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

3.6 加样回收率试验

精密称取6 份已知含量的头花蓼样品0.5000 g，平均分为3 组，分别精密加入0.5、1.0、2.0 mL 混合标准溶液［没食子酸、原儿茶酸、陆地棉苷、槲皮苷、儿茶素、槲皮素-3-O-(2″-没食子酰基)-鼠李糖苷及槲皮素浓度分别为0.407、0.092、0.065、0.228、0.256、0.051、0.383 μg/mL］，制成低、中、高浓度的质控样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述条件进样测定，计算加样回收率，结果低、中、高浓度水平下原儿茶酸等7 种成分回收率分别为93.22%～100.32%、95.37%～102.68%、97.37%～102.11%、94.89%～103.35%、91.23%～104.35%、95.54%～ 103.12%、93.83%～105.33%。

3.7 样品测定

按“2.2”项下方法制备6 批样品的供试品溶液，处理后分别进样测定，根据内标法计算样品中各成分的含量，结果见表3。

表3 6 批样品中7 个成分的含量(mg/g，n=3)Table 3 Determination of 7 components in six batches of P.capitatum sample (mg/g，n=3)

4 讨论

2010年版《中国药典》中对热淋清颗粒的质量控制方法仅以没食子酸为指标［12］，然而不同批次间没食子酸含量略有差异，因此建立一种灵敏、快速、可靠的的定量分析方法以同时测定头花蓼药材中主要活性成分的含量是极其有必要的。

本研究采用UPLC-MRM-MS 系统建立了头花蓼药材中七个指标成分灵敏、快速、可靠的定量分析方法，5 min 即完成样品的分析，显著提高了定量分析的重复性和可靠性。从表4 的6 批头花蓼药材含量测定结果可看出原儿茶酸，陆地棉苷在不同批次药材中含量较稳定，但含量较低，没食子酸、槲皮苷、槲皮素含量较高，6 批药材槲皮素的含量均符合2003版《贵州省中药、民族药质量标准》。经对不同产地的头花蓼中7 种化学成分含量测定，表明本方法能达到有效分离各组分的目的，可作为头花蓼的质量控制方法;同时表明不同地域的头花蓼中3 种成分的含量存在明显差异，说明生态环境、采收时间和储存条件等可能对含量产生影响。上述结果提示，为保证头花蓼相关制剂批次间质量的一致性，应加强头花蓼的质量控制，必要时固定药材的来源。

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