早期妊娠自然流产的绒毛细胞培养及染色体核型分析156例

潘观玉

(暨南大学附属第一医院胎儿医学科，广东广州510630)

自然妊娠流产是一种常见的妇科疾病，其发病率约占临床妊娠的10～20%［1］，并且主要发生于妊娠早期(孕前3个月左右)。自然流产的原因包含多种因素的影响，例如遗传、环境、免疫、内分泌、感染等原因，甚至其他未知因素等［2］。据统计，约有一半以上的流产胚胎存在不同程度的染色体异常［3］。因此，遗传因素特别是染色体异常，被认为是最主要的自然流产诱发因素［4］。所以对自然妊娠流产患者的绒毛样本进行染色体核型分析，不仅对于明确流产原因，减轻患者的经济和心理负担非常重要，对今后开展优生优育也具有很好的理论依据和相关的政策指导方针。本研究针对156例自然流产患者的绒毛细胞培养后染色体核型分析，了解染色体异常的相关情况。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2012年3月至2014年4月于华侨医院妇产科门诊的自然流产患者，孕周5～16周，其中5～10周112例，11～16周44例。平均孕妇年龄20～41岁，平均(28±1)岁。B超提示胎儿停止发育(无心管搏动等)。排除孕期感染及有害物质接触史。

1.2 方法

1.2.1 标本采集和绒毛细胞培养 行清宫手术过程中，无菌抽取绒毛组织约5～15 mg，置于生理盐水中洗涤，以去除影响细胞贴壁的血凝块和其他非绒毛组织。随后在倒置显微镜下挑选绒毛组织，并用灭菌的眼科剪将其剪碎成糊状，将组织悬液移入离心管中 1 500 r/min 10 min，弃去上清液后，加入0.25%的胰酶及500 U/mLⅡ型胶原酶2 mL，吹打混匀。再加入相应体积的血清终止消化，离心弃上清，加入 10 mL AmnioMax－Ⅱ培养基(GIBCO)，混匀后置于37℃、5%CO2培养箱中常规培养。

1.2.2 绒毛细胞培养和染色体制备 细胞培养5～7 d后，于倒置显微镜下观察细胞状态是否贴壁、良好。待细胞生长旺盛且多见梭形细胞克隆后进行换液和传代，继续培养2～3 d。待细胞密度适中时，加入50μg/mL秋水仙素1滴后，阻断细胞周期于中期，继续培养40～60 min后收集细胞，并制备染色体玻片行常规G显带。

1.2.3 G显带染色体核型分析 每例样本于油镜下计数30个核型(镶嵌体则计数100个核型)，分析5个核型。染色体畸变的鉴别及核型描述参照《人类细胞遗传学国际命名体制2009版》。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析处理，计数资料用率表示，两组间的比较用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 培养结果

在156例绒毛组织标本中，细胞培养成功共147例，占总标本数的94.2%。细胞培养失败共计9例(5.8%)，其中3例因绒毛组织取样前已经坏死，细胞无法培养贴壁;另外6例细胞培养时出现污染。

2.2 自然流产绒毛的染色体异常核型分析及分类

147例成功培养的绒毛组织中共检出异常核型67例，染色体异常率为45.5%(67/147)。染色体异常主要为三体型，共检出62例，占异常核型的92.54%(62/67)。其中 21－三体(图 1A)32例，占异常核型的47.76%(32/67);18－三体(图1B)9例，占异常核型的13.43%(9/67);16－三体5例，占异常核型的7.46%(5/67);13－三体5例，占异常核型的7.46%(5/67);47，XXY 1例，占异常核型的1.49%(1/67);47，XY，+22 4例，占异常核型的5.97%(4/67);47，XX，+21/46，XX 3 例，占异常核型的 4.48%(3/67);47，XX+8/46，XX 3 例，占异常核型的 4.48%(3/67);48，XY，+7，+14 2 例，占异常核型的2.99%(2/67);45，X 2例，占异常核型的2.99%(2/67);69，XXX(Y)/46，XX 1 例，占异常核型的1.49%(1/67)，见表1。

图1 染色体异常的核型分析

表1 67例自然流产绒毛染色体异常核型结果与分类

2.3 流产次数与染色体异常核型的关系

在78例反复流产(≥2次)的患者中，绒毛细胞样本染色体核型异常者有45例，占总异常核型病例的57.7%(45/78)。69例单一流产患者中绒毛细胞样本染色体核型异常者22例，占总异常核型病例的31.9%(22/69)。经χ2分析，反复流产患者染色体核型的异常发生率显著高于单一流产患者(χ2=1.26，P=0.013)，差异有统计学意义，见表 2。

表2 流产次数与染色体异常核型之间的关系

2.4 自然流产患者胚胎性别和染色体异常核型的关系

在147例自然流产患者的胚胎中，女性胚胎89例，占总流产患者的60.5%(89/147)，男性胚胎58例，占总流产患者的39.5%(58/147)。女性胚胎中染色体异常核型48例(48.9%，48/89)，男性胚胎19例(32.8%，19/58)。经χ2统计在自然流产胚胎的女性胚胎染色体异常核型的发生率显著高于男性胚胎(χ2=1.89，P=0.035)，见表 3。

表3 自然流产胚胎性别与染色体异常核型之间的关系

2.5 自然流产患者的孕周数与染色体异常核型的关系

在147例自然流产患者的胚胎中，早期流产患者(孕周＜12 w)95例，占总流产患者的64.6%(105/147)，晚期流产患者(孕周≥12 w)52例，占总流产患者的35.4%(42/147)。早期流产患者染色体核型异常有51例(53.7%，51/95)，晚期流产患者16例(30.8%，16/52)。经 χ2统计发现，早期流产患者中，染色体核型的异常发生率明显高于晚期流产患者(χ2=2.33，P=0.05)，见表 4。

表4 自然流产患者的孕周数与染色体异常核型的关系

3 讨论

在临床中大概有10%～20%的妊娠者会发生自然流产的现象，不仅给患者带来了较为严重的心理和精神创伤，同时也对整个家庭造成了极大的痛苦和相当的经济压力。因此，自然流产的发病机制研究一直是医学界研究的重点和热点。临床研究发现，约有一半以上的自然流产是由染色体核型异常所导致的［5－6］。因此，对自然流产胎儿进行染色体核型分析，不仅可以对临床上流产的问题进行调查分析，减轻患者的心理和精神分析，还可以有效指导下一次的受孕。绒毛组织是受精卵在发育过程中所形成的重要附属物，与胚胎细胞一样具有相同的生物遗传学特性，因此被广泛应用于产前诊断［7－8］。本研究针对自然流产患者的绒毛进行细胞培养后并行染色体核型分析。结果发现在147例自然流产的胎儿绒毛组织中，染色体异常核型共67例，检出率为45.5%。这一结果也于文献报道一致，说明胚胎的染色体异常是导致自然流产的主要原因之一［9］。

染色体异常主要分为染色体数目异常和染色体结构异常两类。据文献报道在自然流产的胎儿中染色体异常96%为数目异常，结构异常仅为4%～5%［10］。非整倍体异常是自然流产胚胎中染色体异常的主要因素，约占染色体异常胚胎的80%以上。在本研究所收集的67例染色体异常的流产胚胎中发现，几乎都为数目异常，这可能也与收集的样本数量有限具有一定的关系。本研究中发现的非整倍体的比例为:21三体32例(占异常核型的47.76%)、18三体9例(占13.43%)、16三体和13三体各5例(占7.46%)、22三体4例(占5.97%)、8三体和21三体(嵌合体)各3例(占4.48%)、7/14复合三体和X单体各2例(占2.99%)。根据以往报道发现，三体型出现频率最高的染色体是 21、16、18、13、22号，本研究的结果与文献报道相符［11－12］。这些结果说明胚胎的染色体异常是自然流产的主要因素，其不仅以非整倍体的为主要表现形式，而且具体的类型比较集中，数目异常明显多于结构异常。这一趋势将为临床诊断和相关领域的研究提供可靠的数据支持和理论基础。

本研究发现，流产次数、流产胎儿的性别以及自然流产患者的孕周数与胚胎染色体的异常之间均存在一定的联系。在反复流产(≥2次)的患者，自然流产的女性胚胎和自然早期流产的患者(孕周＜12 w)中，染色体核型异常的发生率明显高于正常核型，这也提示我们在今后的临床检测和预防工作中，要加强对不同染色体异常情况的监测，做到早预防、早发现、早诊断，从而提高优生优育工作的效率。

本研究还发现，在147例成功培养的自然流产的胎儿绒毛组织样本中，女性为89例，约占总流产患者的60.5%;而在67例染色体异常的胚胎中，女性为48例，约占总染色体异常胚胎的71.6%。说明不论在自然流产胎儿还是在染色体异常的胎儿中，女性胚胎的比例明显高于男性，这也与其他文献报道的性别特异性的胚胎淘汰现象相符［13］。然而，上述性别倾向性的具体机制目前仍不明朗，可能有其他的因素导致了女性胚胎的自然流产的高发生率，也可能是因为病例收集的数量有限，因此后续实验需要更大的样本量来深入研究证实这一现象［14］。

与此同时，我们研究也发现染色体的核型异常所导致的流产现象与发育的不同阶段(孕周数)有着密切的联系。通常在2周左右的流产儿约60%存在染色体异常的情况，而在4～20周左右，其异常率则降为43%。并且在不同时期中，染色体异常的类型往往也是不同的，因此这也提示我们在临床的检测和诊断过程中要更加细致地去研究和区分相关的差异。在本研究中，早期流产患者(＜12w)胚胎的异常核型以21－三体和18－三体最为常见(分别占23%和17%)。而在晚期流产患者胚胎中，异常核型以16－三体最多(约占14%)。这些结果提示我们，染色体异常胚胎的存活率普遍不高，容易发生早期流产，需要在临床的诊断、治疗和预防方面加以重视。

综上所述，胎儿的染色体异常是临床上自然流产的主要诱因。如果能广泛对针对流产的胚胎进行大规模的染色体核型分析及相关的生化检验，将有效地提高优生优育工作的效率，并为相关政策法规提供评估和指导意见。与此同时，随着科学技术手段的进步，更多新型的检测方法也将应用于临床诊断和流行病学统计分析，将为更多的面临生育困难的家庭带来福音。

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