let-7对鼻咽癌细胞增殖及迁移的影响

郑明奋 张学辉 邹苑斌 张沈华 黄杰波

(广东省第二人民医院耳鼻咽喉头颈外科，广东广州510317)

鼻咽癌是来源于鼻咽黏膜上皮细胞的鳞状细胞癌恶性肿瘤。在中国广东、广西等地区鼻咽癌的发病率很高，且其5年生存率不高于70%［1］。鼻咽癌是一种与多种因素相关的疾病［2］，遗传和表观遗传修饰在鼻咽癌的发生发展中发挥着重要的作用［3］。EB病毒感染、吸烟、喝酒都与鼻咽癌的发生有着密切的联系［4］。尽管局部放疗能在一定程度上抑制鼻咽癌的发展，但仍有约30%～40%的患者在4年内发生远处转移［2］。因此，了解其发病机制对于防治鼻咽癌具有重要意义。

最近的研究发现，microRNA的调节异常与多种肿瘤的发生发展有着密切的关系。microRNA是内源性的单链非编码微分子RNA，普遍存在动植物体内，长度一般约为22个核苷酸［5］。然而，microRNA在鼻咽癌的发病机制研究中尚未阐明［6，7］。let－7 是最早发现的一种 microRNA，研究表明let－7家族在多数肿瘤内呈低表达［8］，并且发现 let－7可以抑制肿瘤细胞的增殖，转移，侵袭，并与预后相关［9］，因此推测其可能成为潜在的治疗靶点和预后标记物。本研究通过转染let－7模拟物，增加细胞内let－7的表达研究let－7对鼻咽癌细胞增殖及细胞周期以及鼻咽癌细胞迁移的影响，进一步探索let－7抑制鼻咽癌细胞增殖的可能机制。本研究为临床治疗鼻咽癌的新靶点提供基础，也为其他肿瘤基因治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 正常人鼻咽部永生化上皮细胞NP69，人鼻咽癌 CNE－1和 CNE－2细胞，购自美国ATCC公司。

1.1.2 主要试剂 let－7 microRNA模拟物及对照的microRNA购于美国Dharmacon公司;RPMI1640培养基、0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司;胎牛血清:浙江四季青公司;Keratinocyte－SFM 培养基，Lipofectamine2000转染试剂和 Trizol试剂购自美国Invitrogen公司;噻唑蓝(MTT)购自美国 Sigma公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit逆转录试剂盒及SYBR®Premix Ex TaqTM实时定量PCR试剂盒购自TakaRa;细胞周期蛋白依赖性激酶 (cyclindependent kinase，CDK)6，c－myc 兔抗人单克隆抗体购于美国 Cell Signaling Technology;Anti－β－actin 抗体和Anti－rabbit HRP酶标IgG抗体购于美国Sigma－Aldrich;细胞培养瓶、细胞培养平板购自美国Corning;RIPA裂解液购于北京鼎国昌盛生物技术公司。细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 正常人鼻咽部永生化细胞NP69接种于含10%胎牛血清的新鲜Keratinocyte－SFM培养基中，CNE－1和CNE－2细胞接种于含10%胎牛血清的新鲜RPM I1640培养基中，含100 U/L青霉素，100 mg/L链霉素，置于37℃、饱和湿度，5%CO2的培养箱中。

1.2.2 引物设计及合成 let－7 microRNA及内参U6引物由大连宝生物公司设计并合成，其中let－7的引物序列为:5′－ TGAGGTAGGAGGTTGTATAGTT－3′，内参 U6的引物序列为:5′－CTCGCTTCGGCAGCACA－3′。

1.2.3 let－7在鼻咽癌细胞中的表达 提取正常鼻咽部永生化上皮细胞NP69，鼻咽癌细胞CNE－1和CNE－2总RNA并逆转录，用荧光定量PCR的方法检测这些细胞中 let－7 的表达。

1.2.4 细胞转染和荧光定量RT－PCR 取对数生长的细胞经胰酶消化、重悬铺6孔板，4×105/孔。实验设置let－7模拟物组，阴性对照(对照microRNA)组及空白对照3组。其中空白对照组只转染Lipofectamine2000，阴性对照组为 对照 microRNA+Lipofectamine2000，let－7 组为 let－7+Lipofectamine2000，按照 Lipofectamine2000使用说明转染。设置5个不同浓度梯度组，分别为10、20、50、80、100 nmol/L组，使用荧光显微镜观测转染羧基荧光素(FAM)标记的目的 microRNA，确定其转染效率。用荧光定量 RT－PCR 进一步验证let－7在CNE－2细胞中的相对表达量。每个样品3个复孔;PCR两步法条件:95℃ 10 s预 变 性 ;然 后 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循，各样品采用U6作为内参，let－7相对表达量采用2－CT方法计算。

1.2.5 细胞生长曲线测定 将处于对数生长期的细胞经胰酶消化、重悬以 1×104/孔铺24孔板，设3个复孔，待细胞贴壁后，弃去每孔培养液。加入含let－7(50 nmol/L)和NC microRNA 的新鲜培养液，另设置只加Lipofectamine2000的阴性对照组和不加细胞只加培养基的空白对照组。常规培养，于24、48、72和96 h用细胞计数板进行活细胞计数，每组3孔，取平均值绘制细胞生长曲线。

1.2.6 MTT法检测细胞增殖率 将处于对数生长期的细胞经胰酶消化、重悬按每孔100μL种于96孔板，每孔含1×103细胞，设7个复孔，培养24 h，弃去每孔培养液。加入含let－7(50 nmol/L)和NC microRNA的新鲜培养液，另设置只加Lipofectamine2000的阴性对照组和不加细胞只加培养基的空白对照组。加药后分别继续培养24、48、72 h 和96 h，每孔加入15 μL MTT，4 h 后吸弃孔中液体，每孔加入100μL二甲基亚砜溶液，振荡10 min，酶标仪570 nm测A值，取平均值绘制细胞增殖曲线。

1.2.7 细胞划痕实验 取对数生长期的 CNE－2细胞，将细胞按 5×105/孔分别接种至 6孔板内，每组设3个复孔，常规培养至融合度达到100%形成单层细胞后，用10μL无菌枪头沿孔底呈“一”字形划痕，PBS轻柔洗涤，加入无血清培养基继续培养，应用Image J软件观察并测量划痕0、48 h后细胞向致伤区迁移的距离，计算不同视野中10处划痕宽度，取其均值，根据原始细胞致伤区距离计算出细胞相对迁移率。胞迁移率(%)=(原划痕宽度－现划痕宽度)/原划痕宽度 ×100% 。

1.2.8 细胞周期检测 细胞收集后以冰PBS洗涤，75%冰乙醇振荡混匀，4℃固定过夜，洗涤离心后PBS重悬细胞，加RNA水解酶37%30 min，之后碘化丙啶室温避光染色30 min，流式细胞仪行细胞周期检测，重复3次。

(1)调节阀分为手动调节阀和电动调节阀两种。电动调节阀一般是由电气仪表专业根据设计参数进行选型。冷、热源系统中安装手动调节阀的位置一般在：①分水器的各个分支管上，对各支路流量进行调节；②换热器一次水的回水管上，调节换热器的供热量。手动调节阀要选择阀门开度和流量基本为等百分比型的，要根据管道的最大流量值确定调节阀的口径，一般情况下阀的口径要小于所安装管道的管径。

1.2.9 细胞周期相关调控因子检测 收集对照组和实验组 3组细胞，Trizol提取细胞总 RNA，按PScript@One Step RT－PCR Kit说明书进行反转录，SYBRTMPremix Ex TaqⅢ进行荧光定量 RT－PCR检测。细胞周期调控因子引物见表1。反应条件:95℃ 30 s热启动;95℃ 5 s变性，60℃ 34 s退火延伸，40个循环，每个样品设3个复孔，重复3次。

1.2.10 Western blotting检测c－myc和CDK6的表达取对数生长期状态良好的CNE－2细胞，以4×105个细胞每孔接种于 6孔板中，瞬时转染 let－7(50 nmol/L)和对照microRNA 72h后去除培养基，PBS洗3遍，RIPA裂解液裂解细胞后，12 000 g 4℃离心5 min，收集上清于－20℃保存。取16μL上述收集的蛋白上清，加入4μL SDS－上样缓冲液，于沸水中变性处理5 min后，等量上样于分离胶浓度10%、浓缩胶浓度5%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳(SDS－PAGE电泳)，电泳完毕后，采用湿转法将蛋白转膜至PVDF膜上，于常温下在脱脂奶粉浓度5%的TBST中封闭 1 h，然后分别加入 Anti－c－myc和 CDK6 抗体(1∶1 000)及 Anti－β－actin 抗体 (1∶3 000)4 ℃过夜，用TBST洗膜4遍后加入2抗Anti－rabbit IgG(1∶10 000)室温孵育1 h，TBST洗膜后加入发光液1 mL，暗室中用感光胶片记录蛋白条带结果。

表1 荧光定量RT-PCR引物

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件分析。计量资料以¯x±s表示，采用One－Way ANOVO统计学方法，P＜0.05认为结果具有统计学意义。

2 结果

2.1 let－7家族在鼻咽癌细胞中的表达

用荧光定量PCR的方法检测let－7家族在鼻咽癌细胞CNE－2和CNE－1中的表达。结果显示，与正常鼻咽部上皮细胞NP69相比，CNE－2和CNE－细胞中 let－7 f家族 (let－7a，－7b，－7c，－7d，－7e，－7g，和 －7i)的表达显著降低(图 1)，P＜0.05。

图1 let-7家族在鼻咽癌细胞(CNE-2和CNE-1)中的表达显著降低

2.2 let－7瞬时转染检测结果

分别使用5个浓度梯度组转染FAM标记的let－7，48 h后荧光显微镜观察转染效率，结果显示:50 nmol/L组的FAM标记 let－7转染效率最高，可高达90% 左右(图2)，因此在后续的转染实验中let－7浓度均选用50 nmol/L。采用荧光定量PCR技术，检测转染let－7模拟物组、阴性对照组和空白对照组CNE－2 细 胞中的 let－7 相对含量，结果表明:let－7 的表达与对照组相比，随着转染浓度的增加而升高，在50 nmol/L处达到最高(图3)。

图2 CNE-2转染let-7(50 nmol/L浓度)模拟物48 h后荧光显微镜观察转染效率(×200)

2.3 let－7 对 CNE－2 细胞生长抑制作用

2.3.1 细胞计数 转染了let－7的实验组与转染了对照microRNA和空白对照组相比，转染了let－7的CNE－2细胞从转染后第3天起细胞增殖明显受抑(图4A)，经统计学分析，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

图3 荧光定量PCR法检测转染let-7后let-7 microRNA的表达

2.3.2 细胞增殖率的检测 MTT法检测细胞存活率来观察let－7对 CNE－2细胞的增殖抑制作用。结果表明，在第1、2天3组细胞的A值经单因素方差分析，差异无统计学意义(P＞0.05)，而在第3天、第4天3组细胞的A值差异均有统计学意义(P＜0.05)(图 4B)。

图4 let-7对CNE-2增殖的抑制作用

2.4 let－7 对 CNE－2 细胞迁移的影响

划痕48h后，转染let－7组的迁移率为 (0.56±0.01)，转染了NC microRNA的阴性对照组为(0.85±0.02)，空白对照组迁移率为 (0.83±0.03)，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。3次重复实验结果显示，与空白组和阴性对照组相比，转染let－7后明显抑制鼻咽癌CNE－2细胞的迁移能力，见图 5－6。

图5 let-7对CNE-2迁移的抑制作用

图6 let-7对CNE-2迁移的抑制比较

2.5 let－7 对 CNE－2 细胞周期的影响

let－7可显著影响鼻咽癌细胞周期分布(图7)，使G0－G1期比例由68.23%±2.03%升高到82.90%±1.98%，两者比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，S期比例由22.07%±1.14%降低到5.80%±0.87%(P＜0.05)，G2－M期比例由8.86%±1.10%升高到11.46%±1.60%，差异无统计学意义(P＞0.05)，见图 7－8。

图7 let-7对细胞周期的影响

2.6 let－7对细胞周期调控因子的影响

应用荧光定量PCR法检测3组细胞的多种细胞周期调控因子的表达水平，结果显示高表达let－7后CDK6及 c－myc的 mRNA表达水平分别下降61.89%和58.21%，其他因子的表达差异无统计学意义(图9)。对 CDK6及 c－myc行免疫印迹法检测，结果显示，过表达let－7后CDK6及c－myc的表达亦下调(图10)。

图8 let-7对细胞周期的影响比较

图9 let-7对CNE-2细胞周期调控因子的影响

图10 Western blotting检测过表达let-7后c-myc和CDK 6蛋白水平的表达及比较

3 讨论

microRNA的表达调控异常与多种肿瘤相关，在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。microRNA参与肿瘤细胞的许多生物学活动，如细胞增殖，分化和凋亡等［10－15］，进而导致细胞周期和末端分化异常。因此，以microRNA为切入点，展开肿瘤相关microRNA的调控机理研究，对阐明肿瘤发生机制及肿瘤治疗具有重要意义。let－7是最早发现的一种microRNA，人 let－7 家族有 13 个成员，包括 let－7a 1、7a－2、7a－3、7b、7c、7d、7e、7f－l、7f－2、7g、7i、miR－98和 miR－202［16］。let－7 家族是一种抑癌 microRNA，在多种肿瘤中表达下调［17－18］，并且 let－7 家族可以作为肿瘤预后的标记物，因为let－7家族的低表达与肿瘤预后不良相关，已有研究表明，低 let－7表达与肺癌预后不良相关［19］。

let－7已被公认为在肺癌发生发展中起着关键作用。研究发现，在143例肺癌患者中，44%患者癌组织中let－7家族的表达水平显著低于其在患者癌旁组织中的表达［20］;microRNA 芯片结果提示，let－7家族的表达水平在肺癌组织中表现出特异性降低，而且let－7表达水平低的患者术后存期较短，预后较差［20－21］，但恢复其正常表达有显著的肿瘤抑制作用［22－25］。最近的研究发现，let－7d 在鼻咽癌患者上皮细胞中表达显著降低，且与预后不良相关［26］。但let－7在鼻咽癌发生发展中的作用尚未阐明。本研究通过转染 let－7模拟物使 let－7 在 CNE－2细胞中的表达水平显著升高，并通过细胞计数和MTT实验验证过表达let－7后鼻咽癌细胞生长受到抑制，增殖活性明显下降，差异具有统计学意义。细胞周期结果显示，过表达 let－7后，G0－G1期细胞显著升高，而 S期细胞显著下降，并且过表达let－7可显著抑制细胞的迁移能力。

有研究表明，let－7 是通过抑制 c－myc，RAS，CDK6及CyclinD2的的表达发挥其抑癌作用的。let－7的靶基因包括Ras家族、高迁移率组 A蛋 白、c－myc和细胞周期调节因子(细胞分裂周期基因25A、细胞周期蛋白依赖性激酶6、细胞周期蛋白D2)［23，25，27］。其中最典型的两个是促进细胞增殖的Ras家族和参与细胞增殖分化的高迁移率组A蛋白。let－7可以抑制多种肿瘤中 c－myc的表达，例如结肠癌［28］。

为进一步探讨let－7抑制细胞增殖的机制，我们检测了细胞周期中G1－S调控点上的相关细胞周期蛋白(CCND1、CCND2、CCND3，CCNE1，CCNE2)，细胞周期依赖性激酶(CDK2，CDK4，CDK6)，以及p14，p16，p21，p53，c－myc 以及 pRb 等基因的表达。荧光定量PCR结果提示，过表达let－7后，CDK6和c－myc的表达均显著性下降，蛋白免疫印迹法的结果与荧光定量PCR的结果一致。研究结果表明，let－7可能通过抑制CDK6和c－myc的表达来抑制细胞增殖，本研究的结果与let－7在其他肿瘤中的生物学作用以及作用机制相一致。本研究为基因治疗鼻咽癌提供了靶标，使基因治疗鼻咽癌成为可能。并且本研究为深入探索let－7在鼻咽癌中的作用及作用机制提供了可靠的依据，也为其他恶性肿瘤的基因治疗提供参考。

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