沙门氏菌的分离鉴定及药敏试验

周忠坤

山东省烟台市福山区动物卫生监督所

一、引言

猪霍乱沙门氏菌属是寄生于人和动物肠道内的无芽胞直杆菌，革兰氏阴性，生化特性和抗原结构相似，兼性厌氧。本属菌现可分为：肠道沙门氏菌和邦戈尔沙门氏菌两个种。 猪霍乱沙门氏菌呈直杆状，0.7～1.5um×2.0～5.0um,革兰氏阴性[1]。在麦康凯琼脂培养基上通常形成无色菌落， 在SS 琼脂培养基上常形成无色但中心稍发黑的菌落，因该菌绝大多数可分解产生H2S，可使三糖铁琼脂培养基变黑。在培养基中加入硫代硫酸钠、胱氨酸、血清、葡萄糖、脑心浸液和甘油等均有助于本菌生长。 本属菌均有致病性，具有极其广泛的动物宿主。本菌最常侵害幼、青年动物，使之发生败血症、胃肠炎及其他组织局部炎症。 沙门氏菌很容易在动物与动物、动物与人、人与人之间通过直接或间接地途径传播，没有中间宿主。 主要传染途径是消化道,猪霍乱沙门氏菌生命力顽强,对外界的抵抗力较强,在冻土中可过冬。对消毒剂的抵抗力不强,3%来苏儿、福尔马林等能将其杀死。 关于沙门菌耐药性机制,主要集中于以下几个方面： 拓扑异构酶基因的突变；抗菌药物摄取或累积量降低；可转移遗传元件介导的耐药性机制；质粒介导的喹诺酮类药物耐药性[2]。

本实验对本地区某猪场患病猪进行了病原菌分离鉴定及药敏试验,为查明病因和进一步选用有效的抗生素进行临床治疗提供科学根据。

二、材料与方法

1.材料

实验动物某猪场患猪。

培养基。 麦糠凯琼脂培养基、SS 琼脂培养基、MH琼脂培养基，均购自广州环凯；营养肉汤培养基、三糖铁琼脂培养基，按照标准方法自行配制。

药敏纸片。药敏试验用16 种药敏纸片，购自由杭州天和。

革兰氏染色液自行配制。

2.试验方法

（1）病料采集及细菌分离。 对某猪场患猪进行病料采集。 将病料用含5%小牛血清的营养肉汤活化，37℃培养24 小时增菌[3]。将浑浊的肉汤培养物用接种环划线接种于麦康凯琼脂培养基和SS 琼脂培养基上，37℃培养24 小时。将麦康凯培养基上的无色菌落和在SS 琼脂培养基上无色， 菌落中心位置发黑的可疑菌落接种于普通肉汤培养基中培养， 用60%甘油保存，并进一步做生化鉴定实验。

（2）细菌鉴定。革兰氏涂片染色法：用接种环挑取单个菌落涂于玻璃片上，采用革兰氏染色，并进行显微镜观察。

三糖铁试验。把营养肉汤中培养的纯菌培养液接种于三糖铁琼脂培养基上，观察是否产气及颜色的变化。

生化试验。 用接种针跳取细菌纯菌落，分别接种于肠杆菌科细菌生化鉴定管中， 温箱中培养24 小时观察。

（3）药敏试验。 纸片扩散方法（K-B）药敏试验,将配制好的菌液1 毫升用涂菌棒均匀涂于MH 平板上，待菌液完全晾干后用灭菌小镊子将药敏纸片轻轻贴于浇好的MH 琼脂上，每个平板贴4 张纸片，每张纸片间距不少于24 毫米， 纸片中心距平皿边缘不少于15 毫米。 温箱中倒置培养24 小时后观察结果。24 小时后将贴有药敏纸片的平皿取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径， 从平板背面测量最接近的整毫米数并记录，抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限[4]。结果依据CLSI 推荐的标准进行分离菌株的耐药性判定。

三、结果

1.培养特性及形态特征

采集的病料经营养肉汤增菌后变浑浊。37℃培养24 小时，在麦糠凯琼脂平板上呈无色菌落，湿润，隆起。SS 琼脂平板上呈无色中心发黑的菌落，见图1。分离菌株革兰染色呈阴性，两端钝圆的短杆菌，无芽孢，无荚膜，都有周身鞭毛，见图2。

图2 革兰氏染色细菌形态

2.三塘铁试验

分离菌株肉汤培养物穿刺斜面后，斜面顶部呈黑色，表明H2S 产生，底部产酸，呈黄色，且上部呈红色。由于沙门氏菌只能利用葡萄糖，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，因接触空气而氧化，细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。

3.生化试验

将分离菌株的肉汤纯培养物接种于肠杆菌科细菌生化鉴定管中培养37℃24 小时， 编码42361 对应菌名为猪霍乱沙门氏菌，鉴定值为95.31%。因此根据生化鉴定结果初步判定该菌为猪霍乱沙门氏菌。结果见表1。

表1 菌株生化鉴定结果

4.药敏试验

分离菌株对链霉素，庆大霉素，多粘菌素B，诺氟沙星，恩诺沙星，氧氟沙星敏感，对卡那霉素，氯霉素，红霉素，头孢噻肟中介，对氨苄西林，四环素，头孢拉定，头孢唑林，呋喃唑酮呈现出不同程度的耐药性。结果见表2。

表2 抗菌药物纸片药敏试验结果

四、讨论

本次试验从患猪体内分离到一株猪霍乱沙门氏菌，并通过药物敏感性试验对该菌的耐药性进行了初步研究。 试验结果表明，对氨苄西林，四环素，头孢拉定，头孢唑林，呋喃唑酮呈现出不同程度的耐药性。总体来说该菌对硝基呋喃类， 四环素类和β-内酰胺类的抗微生物药产生耐药性，如青霉素，头孢菌素等，是兽医临床实践中最常用的抗菌消炎药。 但是，滥用该类抗微生物药， 已经造成敏感菌产生了强大的耐药性，为感染性疾病的治疗带来了巨大的困难[5]。对该区域定期进行监测， 为今后的临床用药提供合理的参考，防止由于盲目用药而造成耐药敏感菌产生，减少由此带来的经济损失。 同时应加强饲养管理, 增强抗病能力；对于患病猪进行无害化处理，做好消毒工作,保持良好的卫生条件。

[1]陆承平. 兽医微生物学[M].中国农业出版社，2001.

[2]肖春玲,姚天爵.细菌耐药性与新抗菌药物的研究[J].中国医学科学院学报,2004, 26(4)：351-353.

[3]刘华伟，马立农等.畜禽及环境中沙门氏菌的PCR快速检测与控制[J].家畜生态学报.2005,2：59-63.

[4]佟金平，王镇山等.磷霉素与14 种抗菌药物分别连用的体外抗菌活性研究[J]. 中国抗生素杂志，2005,4(30)：229-232.

[5]糜租煌.细菌耐药的分子机制[J].临床儿科杂志,2005,23(7)：422-424.