葡萄糖-组胺美拉德产物的生成及对HL-7702细胞生长抑制和细胞周期的影响

张 萌， 倪孔巍， 邹祖全， 张进杰， 杨文鸽*

（1.宁波大学 海洋学院，宁波315211；2.宁波大学 医学院，宁波315211)

葡萄糖-组胺美拉德产物的生成及对HL-7702细胞生长抑制和细胞周期的影响

张 萌1， 倪孔巍1， 邹祖全2， 张进杰1， 杨文鸽*1

（1.宁波大学 海洋学院，宁波315211；2.宁波大学 医学院，宁波315211)

探讨了葡萄糖-组胺美拉德产物 （MRPs)和组胺（Histamine)对人正常肝细胞（HL-7702)生长抑制和细胞周期可能的作用和影响。用不同剂量的葡萄糖-组胺美拉德产物和组胺处理HL-7702细胞，用MTT方法分别检测美拉德产物和组胺对HL-7702细胞的生长抑制效果；用Annexin检测法，在流式细胞仪下观察两种药物对HL-7702细胞周期分布的影响。MRPs和组胺作用于HL-7702细胞24、48、72 h后，对细胞均有生长抑制作用，其抑制作用呈现剂量和时间依赖性。但组胺对HL-7702细胞的生长抑制作用明显强于MRPs；MRPs产物和组胺两种药物作用于细胞72 h后对细胞周期都有一定的影响，其中组胺的作用明显强于MRPs。葡萄糖和组胺生成的产物能显著消减组胺对HL-7702细胞的杀伤作用。

葡萄糖-组胺美拉德产物；组胺；人正常肝细胞（HL-7702)；细胞生长抑制；细胞周期

生物胺（biogenic amine，BA)是一类具有生物活性的含氮脂肪族或杂环类低分子化合物的总称，部分生物胺在体内发挥着重要的生理功能：它是激素、生物碱、核酸和蛋白质合成的前体物质[1]，同时还可以促进生长和代谢、增强肠道系统免疫活性，并在神经系统中发挥活性，如控制血压等[2]。一定量的单胺类化合物对精神活动和大脑皮层有着重要的调节作用，对血管和肌肉有明显的收缩和舒张作用；多胺类在生物体的生长过程中能促进DNA、RNA和蛋白质的合成，以及加速生物体的生长发育等。虽然它在生命体中具有重要的生理功能，但是如果人体摄入过量时，会引起头痛、恶心、心悸、呼吸紊乱等过敏反应，严重的甚至还会危及生命[3]。

常见生物胺中组胺对人类健康的影响最大[4]，它的含量主要取决于食品的特性和微生物的种类。水产品富含蛋白质，在加工和贮藏过程中会产生多肽和氨基酸，这些小分子物质容易进一步转化为生物胺。在水产品加工的过程中，为了降低生物胺的含量，通过物理方法进行消减，如通过超高压、辐照等[5-6]；化学方法如添加剂的使用，如NaCl、保鲜剂、还原糖等。添加还原糖主要是依据美拉德反应原理：美拉德反应主要是指还原糖与氨基酸、肽类和蛋白质之间的复杂反应[7-8]，其中羰基主要来自于还原糖或油脂氧化酸败产生的醛或酮，氨基来源于氨基酸、胺、肽和蛋白质等物质[9]。还原糖和胺类物质在一定的条件下可以进行羰氨缩合反应，既可以降低水产品中生物胺的含量，同时又可以提高产物的抗氧化等特性[10-11]。有研究表明美拉德原料的差异会导致反应产物的差异，对细胞生长、增殖均有不同作用[12]。

作者以体外培养的肝细胞（HL-7702)为模型，研究了组胺和葡萄糖-组胺美拉德反应产物对HL-7702细胞生长抑制和细胞周期的影响，探究基于美拉德反应消减组胺后的的毒性作用，为合理应用美拉德反应这一方法消食品中组胺提供理论基础。

1 实验材料

1.1 主要材料与药品

人正常肝细胞系（HL-7702)：购于中国科学院上海细胞库；RPMI 1640培养基：购于Gibco公司；胰蛋白酶消化液、青霉素和链霉素：购于上海碧云天生物技术有限公司；新生小牛血清：购于杭州四季青公司；葡萄糖：购于国药公司；组胺：购于生物生工公司；噻唑蓝[3-（4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四唑溴蓝MTT]、二甲基亚砜（DMSO)：均购于美国Sigma公司；Cell Cycle Staining Kit：购于联科生物公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

CO2培养箱：美国Thermo公司产品；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台：苏州苏洁净化设备有限公司产品；不锈钢新型电热恒温水槽：宁波江南仪器厂产品；TS-1（数显)脱色摇床：上海洪纪仪器设备有限公司产品；KHB ST-360自动多功能酶标仪：上海科华生物工程有限公司；流式细胞仪：美国BD公司产品。

2 实验方法

2.1 葡萄糖-组胺美拉德产物的制备[13]

分别取0.01 mol组胺和0.02 mol葡萄糖溶于200 mL超纯水中（氨基与葡萄糖的羰基的物质量之比为1∶2)，用 （5 mol/L NaOH或1M HCl)溶液调节pH为10。分装溶液至螺口玻璃管中，充氮气2 min，密封。在120℃条件下，保持60 min，油浴加热。加热结束，冰水浴迅速冷却以使反应停止。冷却后经冷冻干燥机干燥后称量，密封处理，待用。

2.2 细胞培养与传代

HL-7702细胞用含 10%小牛血清的 RPMI1640（含体积分数为1%的青霉素和链霉素)培养基于37℃、体积分数5%CO2的无菌培养箱中培养，待细胞平铺融合后，用胰蛋白酶消化液进行消化传代。观察细胞生长情况，选取对数生长期的细胞用于实验研究。

2.3 MTT法检测美拉德产物、组胺和葡萄糖对HL-7702细胞的生长抑制作用[14-15]

收集对数期细胞，制成细胞悬液，96孔板中每孔接种5 000个细胞，24 h后进行加药处理。本实验葡萄糖-组胺美拉德产物加药浓度设置为5个梯度，分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL，同时设定产物消减前对应的组胺浓度分别为0.047、0.094、0.141、0.188、0.235 mg/mL以及产物消减前对应的葡萄糖浓度分别为 0.158、0.306、0.474、0.612、0.790 mg/ mL。一个浓度设置5个复孔，同时设置对照组和调零组。对照组只加入细胞和培养基，调零组分别加入相同浓度梯度的上述美拉德产物、组胺及葡萄糖。在37℃、CO2体积分数为5%的条件下，分别处理24、48、72 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 uL，继续培养4 h。

吸净孔内培养基，在避光的条件下，每孔加入150 μL DMSO，置于常温摇床上震荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪测定波长为490 nm时各孔的吸光值，并按下面公式计算细胞生长抑制率（%)：

2.4 流式细胞仪检测细胞周期

HL-7702细胞加药处理72 h后，收集各浓度的细胞，制成细胞悬液。在1 000 r/min下离心5 min，弃上清。加入预冷的PBS溶液吹散细胞后再离心，弃上清，重复2～3次后，得到细胞沉淀。用4℃下预冷的体积分数70%乙醇固定，4℃保存，固定24 h以上。取细胞悬液用PBS洗3次后，在避光条件下加入1 mL碘化丙锭染液并于37℃孵育30 min[16-17]，采用流式分析仪检测细胞周期。

2.5 统计学分析

采用SAS 8.0软件对实验数据进行统计One-Way ANOVE分析，每个实验重复3次，实验结果均以平均值±标准差表示，P＜0.05表明差异显著，P＜0.01表明差异极显著。

3 实验结果

3.1 葡萄糖-组胺美拉德产物、组胺和葡萄糖对HL-7702细胞的生长抑制作用

为了表述方便，将3种物质对应质量浓度用字母表示序号，见表1。

表1 MRPs Histamine Glucose对应浓度代表字母Table 1 Letters represented the different concentrations of MRPs and Histamine

MTT法检测结果如表2～4所示，结果表明不同浓度的美拉德产物和组胺对HL-7702细胞具有明显的生长抑制作用，葡萄糖对HL-7702细胞生长抑制作用不显著。同时葡萄糖-组胺美拉德产物又在一定程度上消减了组胺的毒性。

表2 葡萄糖-组胺美拉德产物、组胺和葡萄糖对HL-7702的细胞生长抑制率（24 h)Table 2 Growth inhibition rate of HL-7702 cell affectedby histamine and MRPs（24 h）

表3 葡萄糖-组胺美拉德产物、组胺和葡萄糖对HL-7702的细胞生长抑制率（48 h)Table 3 Growth inhibition rate of HL-7702 cell affected by histamine and MRPs（48 h）

续表3

表4 葡萄糖-组胺美拉德产物、组胺和葡萄糖对HL-7702的细胞生长抑制率（72 h)Table 4 Growth inhibition rate of HL-7702 cell affected by histamine and MRPs（72 h）

从表2～4中可以看出，MRPs和组胺对细胞HL-7702生长均有抑制作用，且在实验浓度范围内抑制作用均呈现剂量依赖性，随着样品质量浓度的增大，HL-7702细胞的生长抑制率增加，而葡萄糖对HL-7702细胞的生长抑制作用不显著，对细胞几乎没有影响。当MRPs和组胺对应序号为a时，24 h细胞生长抑制率分别为2.00%和13.25%，48 h后为2.15%和17.17%，72 h后分别增大到2.20%和27.87%，由此可以看出MRPs对组胺的消减作用与时间呈正相关。经统计分析，不同剂量的MRPs和组胺对HL-7702细胞的生长抑制率存在极显著差异（P＜0.01)，其中组胺对HL-7702对细胞有较强的抑制效果。样品在浓度a～c范围内时差异更为显著。

综上所述，MRPs与组胺相比，在抑制HL-7702细胞生长上存在明显差异。表明葡萄糖的添加极显著地降低了组胺的细胞毒性。

3.2 细胞周期动力学检测结果

通过MTT实验得出，MRPs和组胺作用于HL-7702细胞后其生长抑制率与时间成正相关，并且a、b、c 3个序号可以看出，MRPs毒性显著低于组胺的毒性，结果见图1。因此，分别以0.2、0.4、0.6 mg/ mL的MRPs和0.047、0.094、0.141 mg/mL的组胺作用于HL-7702细胞72 h。

图1 不同质量浓度组胺作用72 h后HL-7702细胞周期的作用Fig.1 Effects of different concentration of histamine on HL-7702 cell cycle

图2 流式细胞仪测得组胺作用72 h对HL-7702细胞周期分布的变化情况Fig.2 Effects on the distribution of HL-7702 cell cycle measured by Histamine for 72 h

由表4可以看出：当组胺浓度分别为0.047、0.094、0.141 mg/mL时，G1期所占比例分别为75.93%、77.85%和80.67%，即随着加药浓度的增大G1期所占比例逐渐增大。与空白对照组相比可知，MRPs将HL-7702细胞阻滞在G1期，并且其阻滞强度呈现剂量依赖性，具有统计学意义。

表4 流式细胞仪测得组胺对HL-7702细胞周期分布的变化情况Table 4 Effects on the distribution of HL-7702 cell cycle measured by Histamine

图3 不同质量浓度MRPs作用72 h后HL-7702细胞周期的作用Fig.3 Effects of different concentration of MRPs on HL-7702 cell cycle

图4 流式细胞仪测得MRPs作用72 h后对HL-7702细胞周期分布的变化情况Fig.4 Effects on the distribution of HL-7702 cell cycle measured by MRPs

表5 流式细胞仪测得MRPs对HL-7702细胞周期分布的变化情况Table 5 Effects on the distribution of HL-7702 cell cycle measured by MRPs

由表5可以看出：当MRPs质量浓度分别为0.2、0.4、0.6 mg/mL时，G1期所占比例分别为75.84%、75.55%和75.19%。与空白对照组相比，MRPs处理细胞后G1期比例轻微增大，即MRPs将HL-7702细胞阻滞在G1期，但是对HL-7702细胞影响不大。

图5 MRPs和组胺对HL-7702细胞周期作用对比图Fig.5 Area chart of HL-7702 cell cycle measured by MRPs and Histamine

通过MRPs和组胺相应浓度的对比 （图5)，当HL-7702细胞处于 G1期时，a、b、c 3个浓度下MRPs对G1的影响都显著低于组胺，分别为75.84%和75.93%，75.55%和77.85%，75.19%和80.76%。经过分析，发现组胺对HL-7702细胞周期阻滞作用显著强于MRPs，可以说明葡萄糖的添加在一定程度上减少了组胺对细胞的周期阻滞作用。

4 结果与讨论

目前，大多数食品发酵生产都离不开微生物的参与，这样就难免产生生物胺。而生物胺在体内的大量积累会导致生物体的不良反应，因此控制食品中生物胺的含量亟不可待。作者研究了MRPs和组胺对人正常肝细胞株HL-7702细胞的生长抑制和细胞周期阻滞的影响，结果发现MRPs产物和组胺都可抑制细胞生长，并且在抑制细胞生长方面还存在浓度和时间依赖性。组胺能够明显阻滞HL-7702细胞周期，MRPs作用效果并不明显。

MTT实验结果显示组胺对HL-7702细胞具有很强的细胞毒性作用，作用时间相同，相应浓度下MRPs极显著地降低了对细胞的生长抑制效果，说明葡萄糖和组胺生成的产物能显著消减组胺对HL-7702细胞的杀伤作用。

作者采用流式细胞仪对HL-7702细胞周期进行分析后得出，MRPs产物和组胺作用于细胞72 h后对细胞都有一定的影响：MRPs将细胞阻滞在G1期，当MRPs质量浓度分别为0.2、0.4、0.6 mg/mL时，S期所占比例分别为 75.84%、75.55% 和75.19%，但对细胞影响不大。组胺作用后细胞明显阻滞在G1期，a、b、c 3个序号下MRPs对G1的影响都显著低于组胺，分别为 75.84% 和 75.93%，75.55%和77.85%，75.19%和80.76%，与MRPs存在显著差异，造成这种现象可能是由于一些影响核酸合成的因素造成DNA复制不完全，使细胞无法正常复制[18-20]，具体原因有待于进一步研究。

通过MRPs和组胺对HL-7702细胞周期结果的分析，得知组胺对HL-7702细胞的阻滞效果明显强于MRPs，并结合MRPs和组胺对HL-7702细胞的生长抑制作用结果，可以说明葡萄糖与组胺发生美拉德反应，能有效减少组胺对细胞的杀伤和阻滞作用。利用葡萄糖与食品中生物胺发生美拉德反应，能起到降低组胺毒性的作用，为应用美拉德反应这一方法消减食品中生物胺的应用可行性提供一定的理论基础。

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Maillard Reaction Between Glucose and Histamine and Its Inhibition on Cell Proliferation and Effect on Cell Cycle of Human Hepatic Cell Line(HL7702)

ZHANG Meng1， NI Kongwei1， ZOU Zuquan2， ZHANG Jinjie1， YANG Wenge*1
（1.School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China；2.Medical School of NingBo University，NingBo 315211，China)

The effects of Maillard reaction products（MRPs)and histamine on the inhibition of cell proliferation and cell cycle of human HL7702 were investigated.Human HL 7702 cells were respectively treated by MRPs and histamine with different concentrations for 24，48 and 72 h，i.e.，0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1 mg/mL for MRPs，and 0.047 mg/mL、0.094 mg/mL、0.141 mg/mL、0.188 mg/mL、0.235 mg/mL for histamine.The inhibition of cell proliferation induced by MRPs and histamine was detected by MTT assay.The effects of MRPs and histamine on the cell cycle distribution in human HL7702 were detected with flow cytometry using Annexin assay. The inhibition of cell proliferation induced by MRPs and histamine was dependent on the treatment concentration and duration，in which the inhibition was observed after 24 h、48 h、72 h treatment inhuman HL7702.Histamine was a stronger inhibitor compared with MRPs.The cell cycle arrest was affected by both MRPs and histamine，while histamine was more effective.In conclusion，MRPs could significantly reduce the histamine-induced cytotoxicity of human HL-7702 cells.

Maillard reaction products（MRPs)，histamine，human hepatic cell line（HL7702)，inhibition on cell proliferation，cell cycle

TS 254

A

1673—1689（2015）07—0704—08

2014-05-19

国家自然科学基金项目 （31201284、81102121)；宁波市农业创新创业重点项目 （2012C92016)；海洋公益性行业科研专项（201305013)；浙江省省级公益性技术应用研究计划项目（2013C32109)。

*通信作者：杨文鸽（1966—)，女，浙江诸暨人，工学博士，教授，主要从事水产品加工研究。E-mail：yangwenge@nbu.edu.cn