分化抑制因子1蛋白和基因在弥漫大B细胞淋巴瘤的表达及意义*

任明强，袁 钟，苏 俊

(遵义医学院附属医院：1血液科;2.病理科，贵州遵义 563003)

论著·临床研究

分化抑制因子1蛋白和基因在弥漫大B细胞淋巴瘤的表达及意义*

任明强1，袁 钟1，苏 俊2

(遵义医学院附属医院：1血液科;2.病理科，贵州遵义 563003)

目的观察弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)组织中分化抑制因子1(Id1)蛋白以及骨髓细胞中Id1基因的表达水平，探讨Id1在评价DLBCL患者病情及预后的临床意义。方法收集2011年10月至2014年10月该院收治的初治DLBCL患者40例为观察组，同期淋巴结反应性增生(RH)的初治患者25例为对照组。采用免疫组织化学SP法分别检测Id1在DLBCL组织和RH组织中的表达水平；采用RT-PCR法分别检测Id1 mRNA在两组患者骨髓细胞中的表达水平。结果观察组DLBCL组织切片Id1蛋白阳性表达率为75.00%(30/40)，而对照组RH组织切片中Id1蛋白阳性表达率为32.00%(8/25)。Id1蛋白在观察组中表达水平明显高于对照组(P=0.001)，观察组中的Id1蛋白表达与患者性别、年龄无关(P>0.05)，与临床分期、乳酸脱氢酶(LDH)高低、结外器官受累情况等影响患者预后的指标有关(P<0.05)。Id1基因在观察组患者的骨髓细胞中表达水平明显高于对照组患者骨髓细胞(Id1 mRNA水平2.80±0.87vs. 1.37±0.51，P<0.05)，且也与临床分期、LDH高低、结外器官受累情况有关(P<0.05)。结论Id1蛋白及Id1 mRNA在DLBCL组织以及骨髓中的表达较RH组织均明显增高，与DLBCL病情预后有关，可能作为未来DLBCL治疗的靶点。

淋巴瘤,大B细胞,弥漫性；淋巴组织增殖性疾病；分化抑制因子1

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphomas，DLBCL)作为非霍奇金淋巴瘤最为常见的亚型，占到非霍奇金淋巴瘤的35%～40%[1]，属于侵袭性淋巴瘤。近年来，伴随对DLBCL发病机制研究的不断深入，人们发现在肿瘤的发生发展过程中，部分分子生物学指标可能起着关键作用。研究发现，分化抑制因子1(Id1)能够负调控转录因子，阻止细胞的正常分化，同时促进其增殖,以及肿瘤血管的形成,与肿瘤的发生发展有关。本文采用免疫组织化学S-P法和RT-PCR法分别检测Id1蛋白在组织以及Id1基因在骨髓细胞中的表达水平，以探讨Id1评价DLBCL患者的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年10月至2014年10月本院病理科确诊的DLBCL初治患者40例为观察组，其中男22例，女18例，年龄19～67岁，中位年龄43岁。淋巴结内原发25例，淋巴结外15例(7例侵犯骨髓)。临床分期根据Ann Arbor-Colswolds分期标准[2]，Ⅰ期8例，Ⅱ期12例，Ⅲ期13例，Ⅳ期7例。另取同时期淋巴结反应性增生(RH)的初治患者25例为对照组，男12例，女13例，年龄21～65岁，中位年龄46岁。两组间性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。所有组织标本均经甲醛固定，石蜡包埋，并切取2 μm厚度切片。同时经患者同意后，对本研究全部65例患者取骨髓标本。40例DLBCL患者均接受以标准CHOP±R方案为主的正规联合化疗。

1.2 主要试剂 Anti-Id1抗体[EPR7098]，GTVisionTM Ⅲ抗鼠/兔通用型免疫组织化学检测试剂盒(基因科技上海有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学SP法 严格参照Anti-Id1抗体[EPR7098]以及GTVisionTM Ⅲ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒的说明书进行操作。采用反应性淋巴结增生病理标本作为阴性对照，Anti-Id1抗体[EPR7098]的阳性对照为已知的乳腺癌病理标本。步骤如下：切片-烤片-二甲苯Ⅰ10 min-二甲苯Ⅱ10min-无水乙醇-90%乙醇-80%乙醇-70%乙醇-过氧化氢10 min-蒸馏水冲洗-柠檬酸高压修复-冷却后山羊血清封闭20 min-Anti-Id1抗体，4 ℃冰箱过夜-用PBS冲洗(3 min×3次) -滴加A液(HRP标记聚合物)室温孵育30 min-PBS冲洗(3 min×3次) -DAB显色剂显色后，冲洗，苏木素复染并脱水，烤干后封片。

1.3.2 RT-PCR法 根据Genbank中报道的人Id1的基因序列,用Primer Pre-mier5.0软件设计Id1基因的引物序列。上游引物为5′-AGG TAA ACG TGC TGC TCT ACG AC-3′,下游引物为3′-TTG CTC ACC TTG CGG TTC T-5′,长度91 bp。以β-actin为内参照,设计特异性序列引物。上游引物为5′-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3′,下游引物为5′-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3′,长度186 bp。引物均由大连宝生物工程公司合成。取患者相应骨髓5 mL,用肝素抗凝后,使用淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞,并计数(5～10)×106细胞与Trizol总RNA提取液1 mL混匀，冻存与-20 ℃环境中。采用Trizol法一步提取骨髓单个核细胞的总RNA。产物用20 μL的DEPC水溶解。RNA完整度检测用电泳法,RNA水平和纯度的计算则用紫外分光光度计测量。提取1 μL的总RNA构成10 μL反应体系,并参照逆转录试剂盒说明书以进行cDNA合成。将cDNA用于进一步常规PCR扩增。条件为:94 ℃预变性1 min，94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,71 ℃ 40 s,共30个循环,最后72 ℃延伸5 min。

1.4 结果判定 免疫组织化学SP法结果判定参考过氧化物酶染色法的评分标准[3]，分别对阳性细胞数量和染色强度评分。阳性细胞数：0分为无阳性细胞，1分为阳性细胞数小于25%，2分为阳性细胞数25%～50%，3分为阳性细胞数大于50%；染色强度：0分为无染色，1分为弱染色，2分为中染色，3分为强染色。阳性细胞数分值与染色强度分值之和为细胞得分。0～3分为阴性(-)，>3～<5分为弱阳性(+)，≥5分为强阳性(++)。RT-PCR法结果判定则通过将PCR产物10 μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,同时将100 bp Ladder核酸分子Marker作对照。电泳结果通过凝胶成像分析系统进行Id1半定量。

2 结 果

2.1 Id1蛋白在观察组中表达水平增高 Id1蛋白在观察组初治患者的组织切片中表达水平增高，阳性表达棕色颗粒见于细胞质。在对照组中，Id1蛋白阳性表达主要分布于细胞膜、细胞质。观察组中，40例DLBCL组织切片Id1蛋白阳性表达率为75.00%(30/40)。对照组中，25例RH组织切片Id1蛋白阳性表达率为32.00%(8/25)。两组数据相比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、表1。

A：DLBCL中Id1强阳性表达;B：RH中Id1 弱阳性表达。

图1 Id1在两组中的表达(SP×400)

2.2 Id1蛋白与观察组患者各项临床指标相关性 根据观察组患者初诊时的性别、年龄、Ann Arbor-Colswolds临床分期、乳酸脱氢酶(LDH)高低以及结外器官受累等临床指标进行分组，观察Id1蛋白与各项指标的相关性。结果显示，观察组DLBCL组织中的Id1蛋白与患者性别、年龄无关(P>0.05)，而与临床分期、LDH高低、结外器官受累情况等影响患者预后的指标有关(P<0.05)，见表2。

表1 Id1蛋白在两组中的表达(n)

表2 Id1蛋白在观察组患者按不同临床指标分组中的表达情况(n)

2.3 Id1基因在观察组患者骨髓细胞中的表达水平 Id1在经过RT-PCR扩增之后，呈186 bp条带，而作为内参照的β-actin则呈91 bp条带。与对照组相比，Id1基因在观察组患者的骨髓细胞中表达水平明显增高，且差异有统计学意义(P<0.05)，见图2，表3。观察组患者骨髓细胞中的Id1 mRNA也与患者临床分期、LDH高低、结外器官受累情况等指标有关(P<0.05)，见图2、表4。

M:Marker，50～500 bp；A：Id1基因；B：β-actin基因；1、2、3：DLBCL；4、5、6：RH。

图2 Id1 DNA扩增产物电泳图

表3 Id1 mRNA在两组骨髓细胞中表达水平

表4 Id1mRNA在观察组患者按不同临床指标分组中的表达情况

3 讨 论

DLBCL作为最常见的成人侵袭性淋巴系统肿瘤，病因不明，通常对化疗反应效果佳，与利妥昔单抗联合化疗完全缓解率高，长期无病生存率为50%～60%[2]，但患者也存在治疗后耐药，甚至出现复发，严重影响了DLBCL患者的长期生存与预后。随着对DLBCL发病机制研究的不断深入，人们发现一些异常基因以及其蛋白的表达可能与淋巴瘤的发病有关，其可影响肿瘤细胞生长、分化和凋亡[3]。

Id具有一些癌基因的属性，属于螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix，HLH) 转录因子家族的成员，包括Id1、Id2、Id3、Id4。Id蛋白与造血干细胞、淋巴细胞等的分化有关，影响造血系统、淋巴系统等正常的发育成熟。其中，大量研究表明Id1不仅参与细胞的增殖与分化，还与肿瘤的侵袭力、肿瘤的血管生成以及临床预后密切相关。关于其与前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌等肿瘤相关性的研究已在国内外广泛展开，但DLBCL中关于Id1的研究未见报道。为明确Id1在DLBCL患者的临床意义，通过分析DLBCL组织中分化抑制因子Id1蛋白以及骨髓细胞中Id1基因的表达水平，结果表明Id1蛋白与Id1基因在DLBCL组织中与骨髓细胞中表达水平高于RH。Id1在其他肿瘤中存在过度增高异常表达，如肺癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌等[4-5]，这与本研究结果一致，分析作用机制与其通过抑制肿瘤细胞凋亡与分化、影响肿瘤细胞周期分布、诱导肿瘤细胞增殖、促进肿瘤血管新生与侵袭转移有关[6]，进一步分析预后相关因素表明DLBCL患者组织中的Id1蛋白表达与患者性别、年龄无关，与临床分期、LDH高低、结外器官受累情况等影响患者预后的指标有关，对于合并淋巴结外器官浸润、临床分期的增加、LDH的增高DLBCL患者，患者Id1的表达也相应增加，提示Id1对DLBCL的病情预后判断可能有价值。有研究发现Id1与多种肿瘤的淋巴结转移、浸润范围、分化程度及临床分期相关[7-8]。这将为DLBCL的诊断和治疗提供新的思路，为DLBCL抗肿瘤药物的开发提供新的可能作用靶点，并为了解Id1特异性和非特异性抑制剂在肿瘤治疗的不同阶段的效果提供分子基础。

综上所述，Id1异常高表达可能与DLBCL的发生发展预后有关，ID1可能为DLBCL预后不良指标。但在DLBCL患者中Id1蛋白与其他蛋白互相作用的具体机制以及调控Id1 基因表达的上游因子、下游效应子具体作用机制仍有待于进一步研究。

[1]葛均波,徐永健.内科学[M].北京:人民卫生出版社,2013,596-597.

[2]克晓燕.淋巴瘤诊疗手册[M].北京:人民卫生出版社,2010,180-181.

[3] 沈志祥,朱熊增.恶性淋巴瘤[M].北京:人民卫生出版社,2011,57-60.

[4]Chen D,Forootan SS,Gosney JR.Increased expression of Id1 and Id3 promotes tumorigenicity by enhancing angiogenesis and suppressing apoptosis in small cell lung cancer[J].Genes Cancer，2014，5(56):212-225.

[5]Gumireddy K,Li A,Kossenkov AV.ID1 promotes breast cancer metastasis by S100A9 regulation[J].Mol Cancer Res，2014，12(9):1334-1343.

[6] 朱博,宋超,王萍.ID1蛋白在胃癌组织中的表达及临床意义[J].上海交通大学学报,2013,33(3):298-302.

[7]Yang G，Zhang Y，Xiong J． Downregulation of Id1 by small interfering RNA in gastric cancer inhibits cell growth via the Akt pathway[J].Mol Med Report， 2012,5:1075-1079．

[8]Munipalle PC，Viswanath YK，Davis PA，et al． Prognostic value of hypoxia inducible factor 1α in esophageal squamous cell carcinoma[J]． Dis Esophagus，2011，24:177-181.

Expression and clinical significance of Id1 and its gene in diffuse large B-cell lymphomas*

RenMingqiang1,YuanZhong1,SuJun2

(1.DepartmentofHematology;2.DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563003,China)

ObjectiveTo investigate the expressions and clinical significance of Id1 in diffuse large B-cell Lymphomas (DLBCL) tissue and Id1 gene in bone warrow cell.MethodsForty cases of DLBCL(observation group) and 25 cases of reactive lymphoid hyperplasia (control group) were included in this study which were admitted by our hospital from October 2011 to October 2014.The expression of Id1 proteins in DLBCL and reactive lymphoid hyperplasia were detected by imunohistochemical technique.The expression of Id1 genes in all patients′ marrow cells was detected by reverse-transcriptase polymerase chain reaction.The data were collected and analyzed by designed person.ResultsIn 40 DLBCLs,the positive rate of Id1 were 75.00%(30/40),which was higher than in RHs 32.00%(8/25),with statistic difference(P=0.001).Id1 protein was not correlated with sex and age(P>0.05),but was correlated with clinical stage,LDH level and extranodal infiltration(P<0.05).The expression of Id1 genes in marrow cells in DLBCL was higher than in RH (Id1mRNA level 2.80±0.87vs. 1.37±0.51,P<0.05),and also correlated with clinical stage,LDH level and extranodal infiltration(P<0.05).ConclusionThe expression of Id1 proteins and genes are much higher in DLBCL tissue and marrow and probably related to the prognosis of DLBCL.This discovery would contribute to predicting prognosis of DLBCL,which also could be a therapeutic target of DLBCL in the future.

lymphomas，large B-cell，diffuse;lymphoproliferative disorders;inhibitor of differentiation 1

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.29.003

贵州省科技厅计划项目[黔科合J字(2009)2175号]。

：任明强(1977-)，硕士，副教授，主要从事恶性血液病研究。

R733.1

A

1671-8348(2015)29-4039-03

2015-04-15

2015-06-16)