结肠癌患者CK19的表达及意义

古 丽

（重庆市九龙坡区第五人民医院检验科 409908）

结肠癌是消化道内常见的一种恶性肿瘤，在胃肠道肿瘤中的发病率占据第3位，对人类的健康构成了严重的威胁[1]。有研究指出红细胞角蛋白19（CK19）与结肠癌间有着密切的联系[2]。本研究旨在通过对结肠癌患者体内外周血中CK19基因表达的检测，探讨CK19mRNA水平与结肠癌的临床分期／分型、转移以及诊断的关系，并通过比较实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测mRNA与肿瘤标记物CEA和CA199对于结肠癌的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年3月至2014年5月在本院接受手术治疗的结肠癌患者的临床资料。所有结肠癌患者均需接受术后病理学的相关确诊。并选取同期在本院接受检查的健康者及结肠息肉患者。本研究共纳入研究对象160例，其中结肠癌患者52（结肠癌组），结肠息肉患者55例（结肠息肉组），健康者53例（对照组），一般资料见表1，3组受试者一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 CK19mRNA的测定（q-PCR法） 获取入组受试者的外周血样本，并从每例中吸取5mL与枸橼酸钠抗凝或乙二胺四乙酸（EDTA）混匀；结合CK19基因序列，设计相关的探针和引物，同时要注意引物的相关特异性，防止扩增假基因的出现；心外周血获取核细胞，实施Trizol（深圳晶美生物工程有限公司）法对总核酸进行提取，同时运用紫外分光光度法对核酸的纯度、浓度进行监测；对标本中CK19内的mRNA表达量实施实时荧光定量RT-PCR检测。引物序列，CK19上游引物：5′-ATG TGG TTA CCG TTC CGG GCC-3′，下游引物：5′-AGC TAT CGG TCC GTC AAG TA-3′，Taqman探针FAM-5′-AGG TAC CTA CTG CGT CAC GGT CAT TCC AT-3′。比较结肠癌、结肠息肉及健康人外周血CK19mRNA表达差异，分析CK19mRNA表达情况与结肠癌的肿瘤病理特征间的关系，并比较CK19mRNA与CEA和CA199对于结肠癌的诊断价值。

表1 3组受试者一般资料比较

1.2.2 RT-PCR 测 定反 应 条 件：DNA 模 板；5mmol／L dNTP贮备液；10×PCR缓冲液；耐热的DNA聚合酶；引物。定量方法：依据已知的起始拷贝数标准样品绘制标准曲线，获取未知样品循环数（Ct值），在标准曲线上将样品起始的浓度计算出。

1.2.3 测定血糖 邻甲苯胺法，空腹全血为3.3～5.6 mmol／L，血浆是3.9～6.4mmol／L。检测血清 C EA：酶联免疫吸附法（ELISA）双抗体夹心法。

1.2.4 血清CA199检测 检测血清CA199放射免疫分析法（IRMA）。

1.2.5 计算体质量指数（BMI） BMI＝体质量（kg）÷身高2（m2）。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行分析。计量资料以±s表示，比较采用单因素方差检验，计数资料用率表示，采用χ2检验，CK19mRNA与CEA和CA199对于结肠癌的诊断价值采用ROC曲线分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组受试者的CK19mRNA阳性表达比较 3组受试者RT-PCR所得的CK19mRNA阳性表达数据见表2，结果提示3组受试者外周血的CK19mRNA阳性表达率比较差异有统计学意义（χ2＝54.53，P＜0.01），结肠癌组患者CK19mRNA阳性表达最高。

表2 3组CK19mRNA阳性表达量比较（n）

2.2 结肠癌患者的CK19mRNA阳性表达与肿瘤病理特征相关性 不同病理特征的结肠癌患者所对应的外周血CK19 mRNA阳性表达情况见表3，不同Dukes分期（χ2＝16.14，P＜0.01）、分化程度（χ2＝8.155，P＝0.017）、肝转移情况（χ2＝13.68，P＜0.01）所对应的结肠癌患者的CK19mRNA阳性并不相同，差异均有统计学意义。

表3 结肠癌患者的CK19mRNA阳性表达与肿瘤病理特征相关性[n（%）]

2.3 CK19mRNA、CEA、CA199对于结肠癌的诊断价值比较 将CK19mRNA、CEA、CA199对于结肠癌的诊断价值行ROC曲线分析，结果见图1、表4，CK19mRNA对于结肠癌的诊断价值曲线下面积为0.947，其敏感性和特异性均高于CEA和CA199。

表4 CEA、CA199、CK19mRNA对结肠癌的诊断意义

图1 CEA、CA199、CK19mRNA对结肠癌的诊断意义

3 讨论

结肠癌目前的治愈率并未得到显著改善，其5年的存活率仅为60%，在结肠癌发现的同时部分患者已经出现了肝转移现象，同时接受结肠癌根治术中仍有20%～50%的患者有肝转移的情况出现，此可能是其中的一个原因[3]。故早期发现及诊断结肠癌是否发生了微转移的情况是帮助结肠癌根治术患者提高生存率的核心。微转移主要是指通过血液及淋巴，肿瘤细胞直接种植和侵袭于体腔内或转移至相应的器官或组织[4]。在明显的病灶形成之前很难发现肿瘤转移细胞。所以对转移途径有关联的体腔内积液、淋巴结、骨髓，以及血液的检测对肿瘤的指导治疗、预后判断及诊断都有着极其重要的价值意义[5]。

属于低相对分子质量的CK是组成上皮组织中间丝的一种成分，在上皮起源及正常上皮的肿瘤细胞内表达。据相关研究发现结肠癌患者的外周血中的CK mRNA能帮助医护工作者对结肠癌微转移的监测[6]。但是门静脉血是回流肝脏的肠道血液的一条必经之路，理论上认为结肠癌微转移会率先在门静脉血中发生，所以相比于外周血的检测，对手术中抽取门静脉血，进行CK19mRNA表达的检测更加具有实际的价值意义[7]。目前CK19mRNA是研究较多的CK分子之一，在恶性上皮组织肿瘤中表达较高，但是在外周血及非上皮细胞内却无表达，本实验拟检测CK19基因转录水平，探讨其在结肠癌中的临床意义。

本实验结果发现，CK19mRNA在结肠癌患者中的阳性表达率为48.0%，远远高于结肠息肉患者和健康人的水平，提示CK19mRNA与结肠癌有着一定的相关性。研究结果还发现CK19mRNA的阳性表达情况与结肠癌组织的Dukes分期、分化程度及肿瘤转移情况均存在着一定的关联性，说明CK19表达情况的检测在肿瘤的分期、分化、转移中均有着重要的意义[8]。而针对CK19mRNA对于结肠癌的诊断价值，作者将其与CEA和CA199进行了比较，CK19mRNA对于结肠癌的诊断价值行ROC曲线分析，结果提示其敏感性和特异性均显著优于CEA和CA199，提示CK19mRNA其可以作为结肠癌诊断的一项新肿瘤标志物[9]。还有研究表明，CK19mRNA可以作为结肠癌患者外周血中发生微转移情况的一个良好的指标；同时对CK19mRNA的检测还能帮助医护工作者识别出具有远处转移倾向或复发的高危结肠癌患者，同时对结肠癌患者术后的化疗具有指导性的作用[10]。

综上所述，本研究结果发现CK19mRNA在结肠癌中的表达显著升高，且其表达水平与肿瘤的分期、分级及转移有着重要的相关性，其对于结肠癌的诊断价值优于CEA和CA199。

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