茶多酚对人鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用＊

田梦秋，袁东杰，郑实兴，李庆玉，石书婧，徐志文△

（1.广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉-头颈外科，广西南宁530021；2.南华大学附属南华医院耳鼻喉科，湖南衡阳421002）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）是头颈部常见的恶性肿瘤，高发于我国湖南、广东和广西等地［1］。98%属于低分化鳞状细胞癌，因此目前早期鼻咽癌以放射治疗为主，晚期通过高强度放化疗虽然能够有效控制和杀灭肿瘤细胞，但放化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也造成增殖活跃的正常组织干细胞的损伤，引起诸多毒副反应，5年生存率只有40%［2］，因此安全有效的药物治疗是临床迫切需要解决的问题。

研究报道，天然绿茶提取物茶多酚，已被证实有抗癌等药理作用［3-4］，对正常组织细胞没有毒性［5］，其作用通过抑制基因表达及相关酶的活性、提高机体免疫功能和诱导细胞凋亡等机制来实现［6］，目前茶多酚抑制鼻咽癌血管生成方面的研究目前还较少。肿瘤组织微血管生成是肿瘤转移的前提和基础，因此抗血管形成治疗是控制肿瘤生长非常有潜力的治疗方法。本实验旨在研究茶多酚体内抗鼻咽癌作用及其对血管生成的影响机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人鼻咽癌细胞株HONE1：广西医科大学耳鼻喉实验室培养。动物：BALB／C雄性裸鼠18只，4～6周龄，体质量（20±2）g，广西医科大学动物实验中心饲养，动物质量合格证号：SCXK（桂）2009-0002，饲养于无特定病原体（specific pathogen free，SPF）环境中。

1.2 药物及仪器 茶多酚：黄褐色粉末，纯度98%，购自上海源叶生物科技有限公司。RPMI1640培养基（Hyclone公司），小牛血清（Gibco公司），青链霉素双抗溶液（Solarbio公司），胰蛋白酶（Solarbio公司），HRP 标记GAPDH（康成公司）、兔抗VEGF（proteintech 公司），HRP标记山羊抗兔IgG（联 科 公司），逆转录试剂盒（Roche公司），7300型定量PCR 仪（ABI公司），RIPA 裂解液（碧云天公司），Trizol（Invitrogen公司），PCR引物（Invitrogen公司合成），BCA 蛋白浓度测量试剂盒（碧云天公司），SDS-聚丙烯酰胺（双螺旋公司），Tris（Sigma公司），ECL显影液（Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 裸鼠移植瘤模型的建立与给药 人鼻咽癌敏感细胞株HONE1，常规体外培养，处于对数生长期时胰酶消化、离心后，用无血清的RPMI1640 培养基制备单细胞悬液，浓度为1×107／mL，裸鼠右前腋皮下接种细胞悬液，每只0.2mL（无菌操作），接种后每天同一时间观察，造模成功的标准为瘤块触之质硬且长径大于5mm。将造模成功的18只裸鼠随机分为3组，对照组：0.1mL／10g生理盐水；低剂量组：7.5mg／kg茶多酚；高剂量组：30.0mg／kg茶多酚，每组6 只，腹腔注射给药，隔日1次，共7次。

1.3.2 移植瘤生长情况观察 隔日测量裸鼠体质量、移植瘤最长径（a）及最短径（b），按照公式V＝a×b2／2计算移植瘤体积，绘制生长曲线。末次给药第2天用颈椎脱臼法处死裸鼠，完整解剖出瘤块，称质量，计算抑瘤率（IR），《现代肿瘤治疗药物学》［7］中抗肿瘤药物有效的标准为抑瘤率大于30%，IR（%）＝（1-治疗组平均瘤质量／对照组平均瘤质量）×100%

1.3.3 RT-PCR法检测VEGF mRNA 的表达情况 根据Trizol法提取3组裸鼠瘤组织总RNA。依照逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，ABI7300系统行荧光定量PCR 扩增，设计反应体系为20μL。PCR 反应所用引物序列见表1，以GAPDH 作为内参照。扩增结束后收集溶解曲线，以确定扩增产物的特异性。基因表达分析采用Livak（2-△△Ct）法进行，2-△△Ct值表示目的基因mRNA 表达的差异倍数，△△Ct＝实验组（Ct目的基因-CtGAPDH）-对照组（Ct目的基因-CtGAPDH），生理盐水组为对照组。

表1 实时荧光定量PCR 的引物序列

1.3.4 Western blot法检测VEGF蛋白的表达差异 给药满7次后颈椎脱臼法处死裸鼠，剥离瘤结节，迅速称质量，取部分瘤组织RIPA 细胞裂解液提取蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。20μg 蛋白上样，8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳跑胶分离，转PVDF膜，转膜时间60 min。5%脱脂牛奶室温封闭2h，兔抗VEGF抗体4 ℃孵育过夜，洗膜，HRP标记山羊抗兔IgG 抗体室温标记2h，1×TBST 充分洗膜后，ECL显影液显影，暗盒中压片。Image J软件分析Western blot图片条带吸光度，以GAPDH 为内参照。

1.4 统计学处理 实验数据采用SPSS16.0统计软件，多样本均数比较采用单因素方差分析（One-way ANNOVA），检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 茶多酚对人鼻咽癌细胞HONE1裸鼠移植瘤生长速度的影响 裸鼠接种人鼻咽癌细胞HONE1后，于第7天18只裸鼠全部达到造模标准。相对对照组，给药组（高、低剂量组）肿瘤生长均较慢，其中高剂量组最慢，见图1。

图1 茶多酚对人鼻咽癌HONE1裸鼠移植瘤生长的影响

2.2 茶多酚对荷人鼻咽癌裸鼠移植瘤瘤重的影响 本实验结果示：低剂量组平均抑瘤率为18.82%，高剂量组为47.66%，表明高剂量组茶多酚能有效抑制人鼻咽癌HONE1裸鼠皮下移植瘤生长，并呈浓度相关。而低剂量组抑瘤率为18.82%，效果不明显，见表2。

表2 茶多酚对人鼻咽癌HONE1裸鼠移植的抑瘤率（n＝6）

2.3 RT-PCR 法检测VEGF mRNA 相对表达量 浓度梯度茶多酚作用裸鼠后，移植瘤内VEGF mRNA 表达水平下调，并呈浓度相关，低剂量组为0.78±0.05，高剂量组为0.32±0.12。其中高剂量组下调明显，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 Western blot法检测VEGF蛋白表达量 浓度梯度茶多酚作用裸鼠后，移植瘤内VEGF 蛋白表达量下降。高剂量组蛋白表达量与对照组相比明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 茶多酚对人鼻咽癌HONE1裸鼠移植瘤VEGF蛋白表达量影响

3 讨 论

茶多酚占茶叶干质量的30% 左右，特别在绿茶中水平较多，具有不良反应小、普遍存在、易获取等优势。研究证实茶多酚能抗肿瘤、抗氧化等多种功能，潜藏巨大的实用价值，可发展为新型的抗肿瘤治疗药物。我国茶叶原材料丰富，因此茶多酚的抗肿瘤前景非常可观。

肿瘤的生长和转移依赖于瘤区血管丰富程度。研究发现，实体瘤生长至1 mm3以上如果没有新生血管来提供氧和营养，肿瘤将停滞于休眠状态，也不发生转移［8］，因而有效抑制血管新生，切断肿瘤血供，有望成为肿瘤靶向治疗的一个新途径［9］。VEGF是最重要的促血管生长因子之［10］，在血管生成过程中起关键性的调节作用［11］，可由多种肿瘤细胞分泌，是目前已知的作用最强、特异性最高的血管生长因子，其作用包括增加血管通透性、促进血管内皮增生、增强内皮细胞抗凋亡和刺激体外培养的内皮细胞的迁移等，这些作用促进了肿瘤细胞生长和新生血管的形成［12］。

本课题组前期研究已证实茶多酚体外能明显抑制鼻咽癌细胞增殖，且抑制作用呈浓度依赖关系［13］。本实验中，对照组裸鼠移植瘤生长迅速，而给药组肿瘤生长缓慢，高浓度组的抑瘤率为47.66%（与对照组比较，P＜0.05），提示高浓度茶多酚具有抑制人鼻咽癌细胞HONE1荷瘤裸鼠移植瘤生长的作用。为了进一步明确茶多酚抑制鼻咽癌分子机制，本研究观察茶多酚对鼻咽癌移植瘤组织VEGF 表 达 的 作 用，荧光定量PCR及Western blot法分别观察茶多酚作用后移植瘤VEGF 在mRNA 及蛋白水平上的表达变化，结果表明，与对照组比较，茶多酚可明显下调VEGF的mRNA 和蛋白表达水平，呈浓度依赖性，其中高剂量组变化明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。由此推断，茶多酚能够抑制鼻咽癌肿瘤生成，可能通过在转录水平抑制VEGF mRNA 表达，减少VEGF 产物，从而抑制肿瘤血管生成等作用有关。

综上所述，本实验表明茶多酚对人鼻咽癌HONE1裸鼠皮下移植瘤具有显著的生长抑制作用，为茶多酚应用于鼻咽癌的临床药物治疗提供依据，有望减少鼻咽癌放化疗不良反应，改善患者生活质量。但这些功能在鼻咽癌的防治上仍未得到证明，是其今后在抗鼻咽癌研究的方向，由于目前缺乏完整的对茶多酚的毒理药理学研究，并且对其组成成分没能充分分离提纯，大大限制了茶多酚研究，这也是今后研究的重点方向。

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