石灰性土壤解磷细菌的鉴定及其对土壤无机磷形态的影响

潘 虹，曹翠玲，林雁冰，李 旭，王 莉

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌712100)

石灰性土壤解磷细菌的鉴定及其对土壤无机磷形态的影响

潘 虹，曹翠玲，林雁冰，李 旭，王 莉

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌712100)

【目的】 从北方石灰性土壤中分离筛选解磷细菌，对其进行鉴定，并测定其解磷能力，为筛选高效稳定的解磷菌株提供参考。【方法】 采集陕西杨凌地区白菜、葡萄、猕猴桃3种植物根际土样，采用稀释涂布法分离土壤解磷细菌，对分离到的细菌进行革兰氏染色，观察菌落形态及颜色，测定其生理生化性质，并结合16S rRNA法对其进行鉴定；测定各菌株在固体及液体培养基中的解磷能力大小；分析浇灌无机解磷细菌发酵液后石灰性土壤中无机磷形态及其含量的变化。【结果】 共分离筛选得到10株解磷细菌，其中2株为有机解磷细菌(Y1和Y2)，4株为无机解磷细菌(W1、W2、W3和W4)，其余4株既能分解有机磷，也能分解无机磷，为双解磷细菌(WY1、WY2、WY3和WY4)；分离到的10株解磷细菌为革兰氏阴性菌，其中WY1和Y2为短杆菌，其余均为杆菌。生理生化性质及16S rRNA序列分析结果表明，10株菌株中 8株属于芽孢杆菌属(Bacillus)，其中WY2、W1、W2、W3与腊状芽孢杆菌相似，WY3和W4与苏云金芽孢杆菌相似，WY4与巨大芽孢杆菌相似，Y2与Bacillusaryabhattai相似；WY1和Y1分别与耐寒短杆菌、杨氏柠檬酸杆菌相似。不同类型解磷细菌在固、液体培养基中解磷能力不同；高效液相色谱分析结果表明，筛选得到的无机解磷细菌部分分泌草酸，部分分泌酒石酸。石灰性土壤浇灌无机解磷细菌发酵液后， Ca8-P、Ca2-P含量增加，Fe-P含量减少，Al-P、Ca10-P、O-P含量变化不大。【结论】 石灰性土壤中解磷细菌具有物种多样性，无机解磷细菌能使石灰性土壤中可利用有效磷含量增加。

解磷细菌；石灰性土壤；16S rRNA鉴定；无机磷形态

磷是仅次于氮素的植物第二大营养元素[1]，磷缺乏是限制植物生长的重要因素，农业上往往以施用大量的磷肥来获得最大产量[2-3]。然而施入土壤中的磷肥，极易被土壤固定而不能被作物利用[4-5]。我国有75%的土壤缺磷，特别是石灰性土壤，虽然其全磷含量较高，但能被作物吸收利用的有效磷含量却很低[6-7]。土壤中存在解磷微生物，其能够将土壤中的固态磷分解或矿化成植物可吸收利用的可溶性磷[8]。解磷微生物包括细菌、真菌和放线菌[9]，其中以细菌的解磷效果较好[10]。解磷细菌(Phosphate-solubilizing bacteria，PSB)多为假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)细菌[11]。当前常用的细菌鉴定方法为16S rRNA鉴定法，该法具有准确、快速、灵敏等优点，将其与理化性质结合，可有效地对细菌菌种进行鉴定[12]。磷细菌在我国已应用多年，但发展较为缓慢，究其原因主要是磷细菌种类多、解磷机制不尽相同且较为复杂。目前，关于解磷细菌的研究多局限于菌种的筛选和解磷能力的比较，对其解磷机理并不十分明晰，关于解磷细菌发挥作用的条件、菌种生长最适条件及施入土壤后的活动和消长动态等研究较少[13]。

为了明确石灰性土壤中的解磷细菌类型，进一步探究解磷细菌的解磷机制，开发利用微生物资源，本试验从石灰性土壤中种植的猕猴桃、葡萄、小白菜根际土中分离筛选解磷细菌，对其进行鉴定[14]，比较其在固体、液体培养基中的解磷能力，并进一步探究其中4株无机解磷细菌对石灰性土壤无机磷形态的影响，以期为筛选高效稳定的解磷细菌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 土 样 从陕西杨凌(N34°17′9.81″，E108°04′9.61″)采集白菜、葡萄、猕猴桃3种植物的根际土，取5～10 cm土层的土样，用塑料袋装好密封带回实验室，备用。

1.1.2 培养基 无机磷细菌培养基：葡萄糖10 g，硫酸铵0.5 g，氯化钠0.3 g，氯化钾0.3 g，硫酸镁0.3 g，硫酸亚铁0.03 g，硫酸锰0.03 g，磷酸钙10 g，琼脂18～20 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0[15]。

有机磷细菌培养基(卵黄培养基)：制备基础培养基(牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂 18～20 g，蒸馏水1 000 mL)，分装(每瓶100 mL)，121 ℃高压灭菌15 min，冷却至50 ℃，每瓶内加入500 g/L葡萄糖溶液2 mL和500 g/L卵黄盐水悬液10～15 mL，摇匀，倾注平板[16]。

1.2 解磷细菌的筛选

采用梯度稀释法进行试验，筛选无机解磷和有机解磷细菌时分别采用无机磷细菌培养基和有机磷细菌培养基。样品于30 ℃培养48 h后观察结果，选择出现溶磷圈的菌落，继续划线分离，直至得到单菌落为止。然后进行3次继代培养，筛选出溶磷圈直径(D)与菌落直径(d)比值(D/d)大于2的菌株。

1.3 解磷细菌的鉴定

1.3.1 菌落形态及其革兰氏染色 将无机及有机解磷细菌分别接种到无机磷细菌培养基和卵黄培养基中，30 ℃培养48 h后观察菌落形状、颜色，测量菌落直径，并对分离到的细菌进行革兰氏染色[17]后，在显微镜下观察细菌形态并拍照。

1.3.2 生理生化性质的测定 按照《伯杰氏细菌鉴定手册(第9版)》进行糖醇发酵、淀粉降解、明胶液化、甲基红试验、柠檬酸盐利用试验、硝酸盐还原试验、接触酶试验等，检测解磷细菌的理化性质[18]。

1.3.3 解磷细菌16S rRNA序列分析及系统发育树的构建 1)DNA的提取。采用CTAB法[19]提取解磷细菌基因组DNA。

2)PCR反应。用于16S rRNA扩增的通用引物为：P1，5′-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′；P6，5′-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′。

PCR扩增解磷细菌16S rRNA, 反应体系为50 μL：模板1 μL,dNTP 0.5 μL，上下游引物各0.45 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，10×buffer 5 μL，ddH2O 42.1 μL。反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 45 s，35 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共45个循环；72 ℃，5 min。

3)测序及系统发育树的构建。扩增产物序列测定由上海美吉生物医药科技有限公司完成。将得到的序列在GenBank网站用Clustal X进行多序列比对，选择相似性较高的典型菌株的序列，用MEGA 5.1软件中的Neighbor-joining(NJ) Algorithm方法构建系统发育树，用Bootstrap对系统发育树进行统计检验。

1.4 无机解磷菌发酵液有机酸的测定

将无机解磷细菌及双解磷细菌分别接种到无机磷细菌液体培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养至发酵液OD600为0.5时取样，8 000 r/min离心10 min，取上清液。采用Waters 液相色谱仪测定发酵液中有机酸的种类与含量，色谱条件：C18色谱柱4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相为磷酸盐缓冲液(pH 2.0),流速0.61 mL/min，检测波长210 nm。

1.5 解磷细菌液体解磷能力的测定

将能分解无机磷和有机磷的解磷细菌(无机解磷细菌和有机解磷细菌)分别接种到无机磷和有机磷细菌培养基中，将可分解有机磷和无机磷的解磷细菌(双解磷细菌)分别接种有机、无机磷细菌培养基及混合培养基(有机磷与无机磷细菌培养基按体积比1∶1混合配制)中，30 ℃、180 r/min振荡培养至其发酵液OD600为0.5时(菌体数量为109mL-1)取样，用钼锑抗比色法测定发酵液中有效磷质量浓度[20]。以不接菌的培养基作为空白对照。

1.6 无机解磷细菌发酵液对石灰性土壤中磷形态的影响

将4株无机解磷细菌接种到无机磷细菌液体培养基中，28 ℃、180 r/min振荡培养至发酵液OD600为0.5(菌体数量为109mL-1)时取样，8 000 r/min 离心10 min，取上清液备用。用花盆装风干低磷石灰性土壤500 g，盆底放一直径5 cm定性滤纸透气并防止土壤漏出。将上述各上清液稀释10倍后，按每100 g土加12 mL的比例与土壤拌匀，称质量控水使土壤绝对含水量为20%，每处理重复5次。以浇灌等体积未接种细菌的无机磷细菌液体培养基的土样作为对照(CK)。土样在室内23 ℃下培养4 d(每d补充1次蒸散的水分)后，将土晾干，碾碎混匀后，按照蒋柏藩等[21]的石灰性土壤无机磷分级体系，采用连续提取法，分级测定Ca2-P、Ca8-P、Ca10-P、Fe-P、Al-P、O-P及土壤总磷(TP)含量。

1.7 数据处理

用SPSS 17.0软件对数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 解磷细菌的筛选

本试验共筛选到了10株解磷细菌，其中4株为无机解磷细菌，记作W1、W2、W3、W4；2株为有机解磷细菌，记作Y1、 Y2；其余4株为双解磷细菌，记作WY1、WY2、 WY3、WY4。

2.2 解磷细菌的形态及其菌落特征

培养后，10株解磷细菌菌落颜色及形状呈现多样性。有机解磷细菌菌落多为圆形(图1-A)，少数形状不规则，颜色为淡黄色或黄色，表面光滑；直径较大，Y1和Y2菌落直径分别为6和7.5 mm。双解磷细菌菌落形态及直径在不同培养基中存在差异，在无机磷培养基中与无机解磷细菌相似，在有机磷培养基中与有机解磷细菌相似(图1-B，C)。无机解磷细菌菌落均为圆形，白色或黄色，表面光滑；菌落直径较小，为2.4～2.7 mm(图1-D)。

经革兰氏染色可知，本试验分离得到的10株细菌均为革兰氏阴性菌。光学显微镜观察结果显示，WY1和Y2为短杆菌，其余均为杆菌。

2.3 解磷细菌的生理生化性质

试验结果(表1)显示，10株解磷细菌均能利用葡萄糖、甘露醇、果糖、蔗糖，接触酶试验呈阳性；除WY1和W3外，其余8株可利用淀粉；除W4外，其他菌株均能将明胶液化；除W1外，其余菌株均能还原硝酸盐。除W3和Y1外，其余菌株柠檬酸盐试验均呈阳性；WY4、W2及Y2甲基红试验为阴性，其余菌株为阳性。通过与伯杰氏细菌鉴定手册比对，WY2可鉴定为蜡状芽孢杆菌，WY4可鉴定为巨大芽孢杆菌，其他菌株待鉴。

图1 解磷细菌在有机磷及无机磷细菌培养基中的菌落形态A、B.分别为有机磷培养基培养的有机解磷细菌Y1和双解磷细菌WY2；C、D.分别为无机磷培养基培养的双解磷细菌WY2和无机解磷细菌W2

表1 解磷细菌的生理生化性质Table 1 Physical and chemical properties of PSB

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性，“+/+”代表产酸产气，“+/-”代表产酸不产气。

Note：“+” Represents positive，“-” Represents negative，“+/+” Represents acidogenicity and aerogenesis，“+/-” Represents acidogenicity and anaerogenic

2.4 解磷细菌的16S rRNA鉴定

10株解磷细菌中，WY2、WY3、WY4、W1、W2、W3、W4均属于芽孢杆菌属(图2)，且WY4与巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)聚在一起，其相似度高达100%，WY3和W4与苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringensis)处于同一分支中，相似度为90%，其余几株与蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)最为相似，相似度89%；WY1与耐寒短杆菌(Brevibacteriumfrigoritolerans)最为相似(图3)，相似度为89%；Y1与杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacteryoungae)聚在一起(图4)，相似度为71%；Y2与Bacillusaryabhattai、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)聚在一起(图5)，相似度为73%。从GenBank中获得10株菌的登录号分别是WY1：KF641919；WY2：KF641920；WY3：KF641918；WY4：KF641921；W1：KF641923；W2：KF641924；W3：KF641925；W4：KF641926；Y1：KF641927；Y2：KF641928。

2.5 无机和双解磷细菌发酵液中的有机酸种类及其含量

表2显示，无机解磷细菌W3和W4分泌酒石酸，无机解磷细菌W1和W2及4株双解磷细菌均分泌草酸，且W3和W4分泌的酒石酸质量浓度远大于其他菌株分泌的草酸。

2.6 解磷细菌菌株在不同培养基中的解磷能力

2.6.1 固体培养基 菌株解磷能力的定性检验以其在固体培养基中溶磷圈直径、菌落直径及二者的比值(D/d)来表示。表3表明，总体来看，有机解磷细菌的溶磷圈直径大于无机和双解磷细菌。有机解磷细菌Y1和Y2的D/d值分别是9.2和8，显然Y1比Y2解磷能力强。无机解磷细菌中，W1的D/d值最大(4.8)，其次是W3和W4，W2的最小，说明W1在固体培养基中分解无机磷的能力最强，W3，W4次之，W2最小。双解磷细菌的D/d值比较复杂，除WY4外，其余3株在有机磷细菌培养基中D/d值均大于无机磷细菌培养基，说明双解磷细菌部分适合分解有机磷，部分适合分解无机磷。

图2 基于16S rRNA的解磷细菌菌株WY2～WY4、W1～W4与其他菌株的系统发育树

图3 基于16S rRNA的解磷细菌菌株WY1与其他菌株的系统发育树

图4 基于16S rRNA的有机解磷细菌菌株Y1与其他菌株的系统发育树

图5 基于16S rRNA的有机解磷细菌菌株Y2与其他菌株的系统发育树

表2 无机和双解磷细菌菌株发酵液中的有机酸种类及其质量浓度Table 2 Type and quantity of organic acids secreted by inorganic and dual function PSB

表3 解磷细菌菌株在不同固体培养基中的菌落直径和溶磷圈直径Table 3 Size of colony and phosphate-solubilizing zone of PSB

注：Y1和WY1的菌落和溶磷圈为不规则形状，故其直径用范围表示；同一指标不同菌株相比数据后标不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)。

Note：Shapes of colony and phosphate-solubilizing zone of Y1 and WY are irregularity and showed as diameter range.Compare the same indicator of different strains,letters after the figures representative significant difference (P<0.05).

2.6.2 液体培养基 解磷细菌液体发酵后发酵液中有效磷质量浓度可以用来定量表示解磷细菌解磷能力的大小。图6显示，4株无机解磷细菌处理的无机磷细菌液体培养基中有效磷质量浓度差异显著，W1发酵后发酵液有效磷质量浓度最高，为 14.86 μg/mL； W2中有效磷质量浓度最低，仅为1 μg/mL，W3和W4中有效磷质量浓度介于二者之间。有机解磷细菌Y1和Y2处理的有机磷细菌液体培养基中有效磷质量浓度相差不大，分别为9.84 和9.53 μg/mL。在有机磷细菌液体培养基中，4个双解磷细菌发酵液有效磷质量浓度均最高，其中WY1的解磷能力最强，其发酵液中有效磷质量浓度为20 μg/mL，远远大于其余3株菌，其次是WY3和WY4，而WY2最小，有效磷质量浓度仅为8 μg/mL；在无机磷细菌液体培养基中，有效磷质量浓度由高到低依次为WY4>WY3、WY1>WY2。在有机与无机混合液体培养基中，WY3有效磷质量浓度最大，其次为WY2和WY4，WY1最小。由此可知，双解磷细菌的解磷能力可能与其分解的有机磷和无机磷比例有关。

图6 10株解磷细菌发酵液中有效磷质量浓度的比较 图柱上标不同小写字母表示差异显著
Fig.6 Content of available phosphorus in the fermentation broth of 10 PSB strains Different letters on bars indicate significant difference

2.7 无机解磷菌发酵液对石灰性土壤无机磷形态的影响

从图7和8可以看出，加入4种无机解磷细菌发酵液后，Ca2-P、Ca8-P含量均有不同程度增加。Ca2-P是作物最容易利用的磷，而W3和W4能较大幅度地提高其含量，说明W3和W4是适宜溶解石灰性土壤难溶磷的菌株。对于Fe-P而言，只有W2菌株发酵液明显提高了Fe-P含量，而其他3个菌株发酵液都使Fe-P降低，说明不同无机解磷细菌分解磷的机制可能有所不同。4种无机磷解磷细菌发酵液对土壤Al-P、O-P、Ca10-P和TP含量影响不大，这可能是由于Al-P、O-P、Ca10-P和的有效性都很低，是植物的潜在磷源[20]。此外，石灰性土壤中O-P比较稳定，由于被氧化铁胶膜包被，这类磷酸盐在弱酸下很难被分解出来，故无机解磷细菌对其影响比较小。

图7 无机解磷细菌发酵液对石灰性土壤中Ca2-P、Ca8-P、Al-P、Fe-P含量的影响
Fig.7 Different PSB strains of dissolving ability of limy soil phosphorus Ca2-P,Ca8-P,Al-P,Fe-P

比较表2和图6发现，含草酸的W1和W2发酵液溶解石灰性土壤无机磷的能力远大于含酒石酸的W3和W4发酵液，说明草酸溶磷能力大于酒石酸，这与前人的研究结果[22]一致。

图8 无机解磷细菌发酵液对石灰性土壤O-P、Ca10-P含量的影响

3 讨 论

本试验从3种植物根际土壤中筛选得到10株解磷细菌，其中有无机解磷细菌4株，有机解磷细菌2株，双解磷细菌4株；革兰氏染色表明，分离得到的解磷细菌主要以革兰氏阴性杆菌为主，少数是短杆菌；生理生化性质及16S rRNA 鉴定结果表明，10株解磷细菌中，8株是芽孢杆菌属，且分别与巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和Bacillusaryabhattai相似；1株与耐寒短杆菌相似，1株与杨氏柠檬酸杆菌相似。这与国内外报道的多数解磷细菌为假单胞菌属、芽孢杆菌属细菌的结果相似[21]。

D/d值是传统的衡量解磷细菌分解磷能力大小的定性指标。一般认为D/d值越大，细菌分解磷的能力越强[23]。李娟等[22]的研究结果表明，有些菌株在平板上溶磷圈很大，但在液体培养时解磷能力却不强，反之亦然。本研究结果显示，4株无机解磷细菌和2株有机解磷细菌在固体与液体培养基中解磷能力基本一致；但是双解磷细菌在液体与固体培养基中的解磷能力相差较大，这可能是由于不同菌株分解磷的机理不同所致，具体哪一种机理起主导作用，还有待于进一步研究。同时也说明双解磷细菌解磷特性可能会因环境中难溶性有机磷和无机磷的比例不同而发生改变，因此值得对其解磷机制作深入研究。

对比4株无机解磷细菌在固体和液体培养基中的解磷能力，W1菌株固体培养基中D/d值最大，为4.8，在液体培养基中，其发酵液中有效磷质量浓度最高，达15 μg/mL。高效液相测定结果表明，W1和W2发酵液中的有机酸主要是草酸，W3和W4发酵液中的有机酸则主要是酒石酸；从数量上看，W1和W2发酵液中有机酸草酸的质量浓度较低，而W3和W4发酵液中酒石酸的质量浓度较高。Ca2-P是有效磷库的主体，也是植物最易利用的磷形态，Ca8-P对有效磷库起着重要的调节作用[24]，本试验结果表明，解磷细菌发酵液可使石灰性土壤中的Ca2-P和Ca8-P增加，能有效调节植物根系周围的磷库。

解磷细菌对土壤中磷的分解能力应该能真实反映其解磷能力的大小。由本研究结果可以看出，以单位有机酸土壤解磷量来衡量，土壤解磷效果以W2最好。高效液相色谱分析结果表明，W2分泌草酸，解磷细菌分泌的草酸可能是其摄取石灰性土壤磷素的必然机制，是解磷细菌长期适应此类土壤的自然选择。有研究表明，在施用不同有机酸时，草酸对石灰性土壤的解磷效果最好[25-26]，这是因为草酸为高螯合活性有机酸，适合于溶解石灰性土壤中的难溶性无机磷。本研究中，W1和W2分泌的草酸溶磷能力远大于W3和W4分泌的酒石酸，进一步验证了以上研究结果。

本研究结果初步表明，将无机解磷细菌的发酵液直接施用到石灰性土壤中，可提高土壤有效磷含量。对于无机解磷菌的解磷机制，尚需做深入的研究，才能充分发挥土著微生物的解磷优势, 为生产有机菌肥菌株的选育提供理论依据。

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Identification of PSB and their impact on soil inorganic phosphorus

PAN Hong,CAO Cui-ling,LIN Yan-bing,LI Xu,WANG Li

(CollegeofLifeScience,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study isolated phosphate-solubilizing bacteria (PSB) from northern calcareous soils,investigated their species, and detected their ability of solubilizing fixed phosphorus to provide reference for screening highly efficient and stable solubilizing strains.【Method】 Soil samples were collected from the rhizosphere ofBrassicarapachinensis,ActinidiachinensisandVitisviniferain Yangling,Shaanxi province.The soil bacteria were isolated by dilution plate method.Gram stain was employed to observe the bacteria appearance.Physicochemical properties of strains were also measured and combined with the 16S rRNA gene sequencing and blasting to identify the strains.Then the phosphate-solubilizing ability of each strain on solid and liquid medium was detected.After being cultured in liquid medium,inorganic phosphorus morphologies were determined in calcareous soil.【Result】 Ten PSB strains were obtained with 2 of them were organic phosphate-solubilizing bacteria:Y1 and Y2,4 strains were inorganic phosphate-solubilizing bacteria:W1,W2,W3 and W4,and 4 strains with capacity of dissolving both inorganic and organic phosphorus:WY1,WY2,WY3,and WY4.Eight of 10 strains were bacillus while the other 2 strains were bacillus brevisthe.Based on physicochemical properties and 16S rRNA sequence analysis,1 strain belonged toCitrobacteryoungae,1 belonged toBrevibacteriumfrigoritolerans,while the other 8 wereBacillus.Among the 8Bacillusstrains,4 were similar toBacilluscereus,1 belonged toBacillusmegaterium,1 wasBacillusaryabhattai,and 2 wereBacillusthuringiensis.After the inoculation of inorganic phosphate-solubilizing bacteria,the contents of Ca8-P and Ca2-P increased,the content of Fe-P decreased,while the contents of Al-P,Ca10-P and O-P changed slightly.【Conclusion】 PSB of calcareous soil were diverse,and inorganic PSB of calcareous soil increased available phosphorus.

phosphate-solubilizing bacteria;calcareous soil;16S rRNA identification;inorganic phosphorus fractionation

时间:2015-09-09 15:41

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.10.015

2014-03-05

陕西省科技攻关项目(2013K01-38)

潘 虹(1988-)，女，陕西咸阳人，硕士，主要从事微生物资源利用及植物养分研究。E-mail：441595837@qq.com

曹翠玲(1960-)，女，陕西宝鸡人，教授，博士，主要从事植物养分与水分生理研究。E-mail：cuilingcao@tom.com

Q939.96

A

1671-9387(2015)10-0114-09

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150909.1541.030.html