银杏叶提取物对大鼠非酒精性脂肪肝炎肝脏保护作用的研究*

龚 毅，范 伟，张 莹，侯 炬，郭江福，柳 杨

(1.遵义医学院研究生院，贵州遵义 563003；2.贵州省人民医院急诊外科，贵阳 550002；3.贵州省人民医院肝胆外科，贵阳 550002)

论著·基础研究

银杏叶提取物对大鼠非酒精性脂肪肝炎肝脏保护作用的研究*

龚 毅1，范 伟2△，张 莹3，侯 炬1，郭江福2，柳 杨2

(1.遵义医学院研究生院，贵州遵义 563003；2.贵州省人民医院急诊外科，贵阳 550002；3.贵州省人民医院肝胆外科，贵阳 550002)

目的观察银杏叶提取物对非酒精性脂肪肝炎大鼠Toll样受体4(TLR4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等表达的影响。方法雄性SD大鼠分为3组。对照组正常饮食，模型组、治疗组给予高脂饲料喂养16周诱发脂肪性肝炎后分别以生理盐水、银杏叶提取物液10 mL/kg灌胃，每日1次，共8周。处死大鼠，分别进行如下检测:(1)观察肝脏病理变化；(2)检测TLR4表达水平；(3)检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平及血清TNF-α水平。结果(1)治疗组和模型组均有不同程度的肝细胞脂肪变性，且治疗组轻于模型组。 (2)模型组、治疗组TLR4 mRNA及蛋白、TNF-α表达高于对照组，模型组又高于治疗组，差异有统计学意义。对照组血清ALT、AST明显低于模型组及治疗组，治疗组又低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论银杏叶提取物对非酒精性脂肪肝炎大鼠有较好的肝脏保护作用，其可能机制与降低TLR4的表达、抑制炎性反应有关。

银杏叶提取物；脂肪肝；Toll样受体；肿瘤坏死因子α

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代谢综合征累及肝脏的表现。随着现代生活水平的提高，非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的发病率增高，由其引起的肝纤维化和肝硬化发病率也有上升趋势[1-3]，探讨其发病机制是当前研究的热点问题。黄酮类化合物和银杏内酯是银杏叶提取物[4](EGb)的主要成分，药理作用非常广泛，具有调节脂肪代谢及抗氧化等相关作用，且其主要成分黄酮化合物还有清除自由基等作用[5-6]。本研究通过探讨银杏叶提取物对Toll样受体4(TLR4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等在非酒精性脂肪肝炎大鼠肝脏表达的影响，探讨其对非酒精性脂肪肝炎的肝保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 30只雄性SD大鼠由军事医学科学院实验动物中心提供，体质量(150±10)g。分为对照组、模型组、治疗组3组，每组10只，大鼠自由进水进食，分笼(每笼5只)饲养于温度(20±2)℃，明暗各12 h的动物实验室内。对照组为正常饮食组(饲料中碳水化合物、脂肪、蛋白质分别占65．5%、10．3%、24．2%)、模型组和治疗组为高脂饮食组[7-9](饲料中88%普通饲料+10%猪油+2%胆固醇，碳水化合物、脂肪、蛋白质分别占总热量的53%、27．4%、19．6%)。模型组、治疗组给予高脂饲料喂养16周诱发脂肪性肝炎后分别以生理盐水、银杏叶提取物液(其中含黄酮24．8%，广西桂林思特新技术公司)10 mL/kg灌胃，每日1次，共8周。给大鼠腹腔注射水合氯醛3 mL/kg，采集肝组织标本及下腔静脉采血后处死。

A:对照组；B:模型组；C:治疗组。

图3 小鼠肝脏HE染色(×200)

表1 各组大鼠ALT、AST、TNF-α、TLR4水平

1.2 方法

1.2.1 肝组织标本的制备和观察 用多聚甲醛固定肝组织后，制备石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察各组肝细胞脂肪变性程度、炎症活动度。

1.2.2 TLR4 mRNA表达情况 Taq酶、DNaseI(RNase free)购自宝生物公司(TaKaRa)，M-Mulv Reverse Transcriptase购自普洛麦格生物技术有限公司(Promega)，RNA提取试剂Tripure reagent为罗氏公司(ROCHE)产品,其余均为国产分析纯试剂。所用PCR引物均由威斯腾生物技术公司合成。取材:分别快速取每组样品的组织约25 mg，按说明书操作提取RNA后。所用引物，TLR4:5′-TCT GCC CTG CCA CCA TTT ACA CAG GTC TAA AGA GAG ATT GAC-3′，697 bp，PCR反应条件94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 50 s,35个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。Actin:5′-CAC CCG CGA GTA CAA CCT TC；CCC ATA CCC ACC ATC ACA CC PCR-3′，207 bp反应条件94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环;72℃延伸10 min;4 ℃保存。Marker是TaKaRa的DL2000 取PCR扩增产物8 μL，在1.0%的琼脂糖上进行凝胶电泳。采用凝胶成像系统获取各样品电泳图。

1.2.3 肝脏组织TLR4检测 按ELISA试剂盒说明检测大鼠肝脏组织 TLR4水平。

1.2.4 血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、TNF-α水平检测 采用全自动生物化学分析仪检测血清ALT、AST水平，采用放射免疫分析法检测血清TNF-α水平。

2 结 果

2.1 模型组大鼠造模均成功，对照组肝脏颜色红润，质软。模型组和治疗组肝脏肿胀，色泽偏黄，质脆。镜下对照组可见肝小叶结构清晰，肝细胞呈放射状排列。模型组和治疗组肝小叶结构模糊，肝细胞排列紊乱，均有不同程度的肝细胞空泡脂肪变性，治疗组肝细胞脂肪变性明显轻于模型组,见图1。

A:对照组；B:模型组；C:治疗组。

图2 各组肝脏TLR4 mRNA的表达情况

2.2 各组TLR4 mRNA的表达 模型组的TLR4 mRNA的表达明显高于对照组,治疗组又低于模型组，见图2。

2.3 各组大鼠ALT、AST、TNF-α、TLR4水平比较 对照组ALT、AST、TNF-α水平、TLR4表达明显低于模型组和治疗组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

3 讨 论

TLR是近年来发现的一种脂多糖受体，其家族成员目前已确认的有10个(TLR 1～10)。其中，TLR2和TLR4为主要成员，TLR2主要介导细菌外毒素所致的炎症反应，TLR4主要介导细菌内毒素所致的炎症反应。当脂多糖经级联活化反应激活TLR4后，其胞内Toll/IL-1R(TIR)结构域招募一系列信号分子，活化核因子(NF)-κB，引起以TNF-α等为主的核心促炎因子的炎症因子级联反应，形成第二次打击力量，导致机体损伤[10-12]。在其信号传导通路中TNF-α起着极为重要的作用，TNF-α可抑制脂蛋白的脂质活性，目前的研究表明高浓度的TNF-α可降低外周组织的脂肪分解，促进肝细胞对三酰甘油的合成与聚集，而富余脂质特别是三酰甘油在肝脏中的沉积是NAFLD形成和发展的前提条件。既往的研究表明，血清内毒素水平升高与TNF-α水平呈显著正相关[13-15]。

本研究结果显示，经过持续16周的高脂饮食喂养，大鼠体质量、肝指数明显升高，病理形态形成NASH。治疗组和模型组均有不同程度的肝细胞脂肪变性，治疗组肝细胞脂肪变性轻于模型组。模型组、治疗组TLR4 mRNA及蛋白表达、TNF-α表达高于对照组，模型组又高于治疗组。对照组血清ALT、AST明显低于模型组及治疗组，治疗组又低于模型组。表明银杏叶提取物对非酒精性脂肪肝炎大鼠有较好的肝脏保护作用，其可能机制与降低TLR4的表达、抑制炎性反应有关。

综上所述，TRL4介导的炎性反应可能是导致非酒精性脂肪肝大鼠肝脏炎症、肝功能损伤的原因之一。银杏叶提取物对肝脏的保护作用可能与其降低TLR4的表达、抑制炎性反应有关。

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总体与样本

根据研究目的确定的同质研究对象的全体(集合)称为总体，包括有限总体和无限总体。从总体中随机抽取的部分观察单位称为样本，样本包含的观察单位数量称为样本含量或样本大小。如为了解某地区10～15岁儿童血钙水平，随机选取该地区3 000名10～15岁儿童并进行血钙检测，则总体为该地区所有10～15岁儿童的血钙检测值，样本为所选取3 000名儿童的血钙检测值，样本含量为3 000例。类似的研究需满足随机抽样原则，即需要采用随机的抽样方法，保证总体中每个个体被选取的机会相同。

Protective effect of ginkgo biloba extract on liver nonalcoholic steatohepatitis rats*

GongYi1,FanWei2△,ZhangYing3,HouJu1,GuoJiangfu2,LiuYang2

(1.GraduateSchool,ZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563003,China;2.DepartmentofEmergencySurgery,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550002,China;3.DepartmentofHepatobiliarySurgery,GuizhouProvincialPeople′sHospital,GuiYang,Guizhou550002,China)

Objective To observe the effect of ginkgo biloba extract on the expression of TLR4 and TNF-α in rat nonalcoholic steatohepatitis.MethodsSD rats were randomly divided into three groups:control group (normal diet),rats in the model group and the treatment group was given high fat diet to induce steatohepatitis for 16 weeks,respectively.Rats in model group were treated with normal saline,rats in treatment group was fed ginkgo biloba extract (10 mL/kg per day,for eight weeks).Then rats were sacrificed,the following tests were performed:(1)The pathological changes in liver;(2)the expression level of TLR4;(3)serum ALT,AST levels and serum TNF-α levels.Results(1)Both treatment group and model group have different levels of hepatic steatosis,and it was lighter in the treatment group.(2)TLR4 mRNA and its protein and TNF-α expression in model group and treatment group were higher than that of the control group,and the model group was higher than the treatment group,the difference was statistically significant.Serum ALT and AST was significantly lower in control group than the model group and the treatment group,the treatment group was lower than model group,the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionGinkgo biloba extract has good protection effect on nonalcoholic steatohepatitis in rats,and the possible mechanism may be the reduction of the expression of TLR4 and the inhibition of inflammatory reaction.

ginkgo biloba extract;fatty liver;Toll-like receptor 4;TNF-α

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.30.005

贵州省省长基金[黔科教办(2007)04]；贵州省科技厅基金[黔科合J(2008)2301]；贵州省科技厅专项基金[黔科合J(2008)-2302号]；贵州省优秀青年科技人才基金[黔科合人字(2011)29号]。

:龚毅(1989-)，硕士，住院医师，主要从事肝胆方向的研究。△

，Tel:13985409773；E-mail:guodongliu777@sina.com。

R657.3

A

1671-8348(2015)30-4190-03

2015-03-08

2015-05-16)