分子生物学技术在水环境微生物研究中的应用

李博伟　郦和生

摘要：简述了核酸杂交技术、聚合酶链式反应（PCR）扩增技术、分子指纹技术和克隆基因文库技术4种分子生物学技术，综述了4种技术在海洋、湖泊、河流和其它水生态系统中微生物多样性的研究进展，研究内容大致可分为三个方向：一是人类活动对水环境微生物多样性的影响；二是种群结构和污染之间的规律；三是菌株的筛选和利用，使人们可以在水环境保护、治理过程中变得更加高效、有的放矢。

关键词：分子生物学技术；水环境；微生物多样性

中图分类号：TU528.59 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2014）04-0224-03

1、引言

分子生物学技术为我们研究微生物的多样性、菌种鉴定和定量分析提供了全新的技术手段，其高速的发展大大提高了我们对复杂微生物体系的分析能力，使我们能够在环境体系与微生物之间建立起一种对应关系。近年来研究人员根据每种技术的特点，在不断完善分析方法的基础上努力降低其分析局限性，使分子生物学技术在水环境微生物多样性研究中的应用领域取得了巨大的进步。微生物作为生态系统中的分解者，在水体修复和自净过程中的作用极为关键，但同时，当环境恶化时我们也可以看到水华、赤潮等现象背后微生物在从中作祟，由此可见，微生物在环境保持和治理过程中存在两面性，人们赖以生存的水环境与微生物之间存在着微妙的关系，相互依存互相影响。本文综述了近年来应用于各种水环境下微生物多样性的分子生物技术，通过研究人们可以在水环境保护、治理过程中变得更加高效、有的放矢。

2、分子生物学技术

分子生物学是研究细胞的物理、化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象之间关系的学科，利用遗传信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等对微生物进行解析。20世纪70年代末至90年代初，基于不同的机理涌现出了大量的分子生物学技术，其中用于研究水环境微生物种群的技术大致可以分为4类：核酸杂交技术，聚合酶链式反应（PCR）扩增技术，分子指纹技术和克隆基因文库技术。

核酸杂交技术的发展起源于20世纪70年代，基于核酸碱基互补配对的原理，用特异性的探针与待测样品的DNA或RNA形成杂交分子的过程。衍生技术：Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、原位杂交（ISH）、荧光原位杂交（FISH）、芯片技术等。

PCR扩增技术的发展起源于20世纪80年代末，其原理为基于目标基因设计一对引物，以目标基因为模板精确地扩增核酸序列。PCR扩增技术的发明对分子生物学技术产生了重大影响，1993年Kary Mullis因在该领域做出的巨大贡献曾获得了当年的诺贝尔化学奖，随后PCR衍生技术大量出现，包括：定量/实时PCR（Q/RT-PCR）、巢式PCR、逆转录PCR、多重PCR、通用引物PCR、竞争PCR等。

分子指纹技术的产生基于PCR扩增技术，是目前应用于水环境微生物研究的最流行的分析方法，其原理为将代表微生物群落结构的核酸分子进行各种形式的凝胶电泳，从而将代表微生物群落中各种不同种群的核酸分子区分开。包括：随机引物DNA多态性扩增（RAPD）、扩增（DNA）限制性酶切片段分析（ARDRA）、单链构象多态性分析（SSCP）、梯度凝胶电泳技术（DGGE/TGGE）、核糖体基因间隙分析（RISA）、限制性长度多态性分析（RFLP）等技术。

克隆基因文库为汇集着基因组所有DNA序列的重组体DNA群体，可以提供精确的微生物分类信息，常用于菌种鉴定，但建库过程费时费力。

3、水环境中微生物多样性的研究

3.1 海洋中微生物种群结构的研究

研究内容大致可分为三个方向：一是人类活动特别是养殖业对海洋微生物多样性的影响；二是赤潮时种群结构的变化；三是海洋菌株的利用。

海洋是地球上最大的天然水体生态系统，已越来越受到人类活动的影响，宋志刚等以中国东海海洋微生物为研究对象，通过PCR-ARDRA技术进行多样性分析，研究发现东海海洋微生物无论是菌种还是菌株层面都具有较高的多样性，微生物种类和数量繁多。随着人类海水养殖规模的扩大、污水排放量的增加及旅游产业的发展，海洋尤其是近海沿岸所承受的环境压力逐年增加，人类活动引发的污染直接导致了大陆周边海洋环境中微生物结构和种群的变化，其中养殖业带来的富营养化作用明显。李佳霖等采用T-RFLP和DGGE技术对大连长山群岛海岸潮间带沉积物中的微生物群落结构进行分析，并通过16S rRNA克隆文库解析微生物群落结构，研究表明，地理位置相近的旅游区与养殖区沉积物中微生物种群结构差异显著，养殖区的微生物群落结构、丰度、香农指数和均匀度均较高，优势微生物为变性细菌、浮霉菌、拟杆菌、放线菌等多个功能类群，其中的红细菌目以及共生的浮霉菌和拟杆菌与赤潮发生直接关联。

由于赤潮、水华等环境恶性事件频发使得人们对海洋微生物的研究越发重视，Laura B.Fandino等曾通过DGGE和1 6S rDNA测序技术在南加利福尼亚沿岸发生甲藻水华期间对微生物种群结构的变化进行了研究，研究表明，微生物的种群组成和代谢与海洋中的富营养化状态变化紧密相连，水华中游离与附着菌群存在显著不同，游离细菌占细菌总数的90%以上，16SrDNA克隆分析的24个结果中7种为类Cytophaga菌属，6种属于变形菌门a亚纲，5种属于变形菌门γ亚纲，其中一些类Cytophaga菌属在降解海水中高分子有机物的过程中发挥了重要作用。

海洋中有大量的特殊微生物未为人类熟知，蕴藏着巨大的生物资源，海洋微生物的研究将为开发利用海洋微生物资源提供重要的参考依据。信艳娟等采集大连湾原油污染海域的海水、海泥和海绵样品，以原油作为唯一碳源分离培养，经16S rRNA克隆文库分析，共获得22个属的50株菌，其中45株具有石油降解性能。近年来新一代的基于大规模DNA序列的方法——GeoChip被广泛应用于海洋微生物群落结构、功能以及微生物群落在生态系统中发挥的功能等研究中。endprint

3.2 河流中微生物种群结构的研究

河流沿岸是人类活动最密集的地区之一，政府对人类活动产生的污水排放及其对河流的影响进行了长期的监控，排污口微生物样本的分析对环境评价具有重要的指导意义，Hidetoshi Urakawa等对运河市政污水排放口的沉积物中的氨氧化细菌的丰度和种群结构进行了研究，分别采用实时定量PCR技术和免疫荧光染色技术，其克隆分析和限制酶分析得到了相似的结果，即在此区域的优势菌种是Nitrosomonas，与其它区域相比该区域缺乏微生物种群的多样性。在水处理落后地区，河流极容易受到人类和动物的粪便污染，其中的肠道病菌会直接威胁人类身体健康，将分子生物技术用于病原体的检测也是分子生物技术的一项重要作用，与传统技术相比具有重大优势，Anouk Martellini等首次采用线粒体DNA序列作为标记引物经单PCR、多重PCR和套嵌PCR分析生活污水、农业径流、养猪场污水和两条被污染河流中的微生物种群，通过基因标记的识别可以快速找出粪便污染源。E.T.Lagally等发明了一种包含PCR扩增、毛细管电泳分析并集成了电子控制和荧光检测的便携式装置，并通过该装置实现快速高效检测大肠杆菌和金黄葡萄球菌。

3.3 湖泊中微生物种群结构的研究

湖泊微生物的多样性研究，有助于人们更为深入地掌握湖泊微生物的分布特征及其在湖泊生态系统中的功能与作用，对深入开展湖泊生态环境研究具有重要的意义。赵兴青等应用PCR-DOGE对南京市玄武湖、莫愁湖和太湖不同位置不同位点的表层沉积物微生物群落结构进行研究比较，结果显示同一湖泊不同采样点DGGE图谱的差异性不大而不同湖泊微生物DGGE条带数目和位置具有明显差异，罗明等采用ARDRA研究罗布泊嗜盐细菌的群落结构和多样性，Halomonas为优势菌群，Chromohalobacter、Halobacillus为次优势菌群。采用ERIC-PCR分析优势菌群Halomonas各菌株的基因组特征，显示出有21种指纹图谱。研究结果揭示，罗布泊嗜盐细菌不仅具有丰富的多样性，还蕴藏着具有地域特点的新菌种资源。湖泊极易受到人类活动的影响产生富营养化问题，随之出现的水华会严重影响湖泊的生态功能与水环境质量。刘庆等在富营养化严重的滇池、巢湖和太湖各选取4个采样点，采用16S～23S rRNA之间的ITS序列作为标记引物，通过T-RFLP分析蓝藻种群结构和多样性，发现蓝藻与电导率、pH值、总有机碳和正磷酸盐有显著相关性。湖泊生态系统微生物在有机物代谢特别是氮磷循环中起着至关重要的作用。

3.4 其他类型水体中微生物种群结构的研究

污水伴随着人类活动而产生，其在水环境总量的占比虽然不大，但其对水环境生态系统的影响却变得越来越大。众所周知，生物处理是污水处理过程中的关键步骤，微生物的种群结构多样性与污水处理效果息息相关。Nico Boon等使用16S rRNA作引物，结合DGGE技术和统计学方法分析生活污水、造纸厂等高含碳的工业废水、食品厂等富含脂类物质的工业废水以及纺织厂工业废水的活性污泥中微生物菌群结构，该研究表明，通过DGGE和16S rRNA技术不仅可以用于比较微生物群落间的差异同样可以作为一种工具用于改善污水处理过程中的监测和控制，改进处理不同种类废水的活性污泥工艺。人工湿地作为一种污水有效净化手段其微生物多样性的研究正变得越来越深入，Bing Xie等利用SSCP图谱分析上海梦清园芦苇人工湿地进出口微生物的多样性，得出异养菌、硝化细菌和反硝化细菌各个季节的分布不一，微生物功能群的分布与湿地中不同营养水平有关。地下水是水环境生态系统中的一部分，正面临着进一步污染的威胁，田扬捷等运用RISA法对垃圾填埋场地下水生态系统中微生物的空间异质性进行定量分析，分析表明：细菌群落在空间上的差异显著大于随时间产生的变化，不同位置和深度的地下水RISA图谱存在明显差异，当垃圾渗沥液向地下环境扩散时，将会获得更多的机会接触到具有对应降解能力的合适细菌。

4、结语

随着分子生物学技术的不断发展，其在水环境领域的地位已变得越来越重要。研究表明，将分子生物学的定量和定性技术结合可以很好地表征微生物群落结构特征，揭示水体污染状况与特征微生物之间的关系，为治理和提高处理效果提供依据；简化分析步骤并将其用于水体监测领域且与其它监测手段配合使用，可以为水环境监测提供可靠的技术支持。水环境中微生物种群结构多样性、生存状态及功能特点信息的获得将大大提高水环境治理能力，并为制定改善环境、修复水土的发展决策提供有力的科学依据。endprint