毛酸浆多酚氧化酶的酶学特性研究

高新新， 位 珍， 常 晨， 刘俊坤， 王 萍

（东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

毛酸浆多酚氧化酶的酶学特性研究

高新新， 位 珍， 常 晨， 刘俊坤， 王 萍*

（东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

以毛酸浆中多酚氧化酶（PPO）为研究对象，采用分光光度法在420 nm处对其酶学特性进行研究。结果表明，毛酸浆PPO的底物邻苯二酚的最适质量分数为0.04%；最适pH为7.0；最适温度为35℃；100℃处理2 min，可使酶完全失活；PPO催化的酶促褐变反应动力学符合米氏方程，动力学参数为Km=0.025 mol/L，Vmax=125 U/min；抗坏血酸、柠檬酸、L-半胱氨酸和亚硫酸钠对PPO酶活性的抑制作用均随浓度的增大而加强，抑制能力由强到弱依次为：抗坏血酸＞柠檬酸＞L-半胱氨酸＞EDTA＞亚硫酸氢钠。

毛酸浆；多酚氧化酶；酶学特性

毛酸浆，俗称菇茑、甜菇娘、黄菇娘等，属茄科酸浆属草本植物，成熟时为黄色，因此有“黄菇娘”之称。原产于南美洲，是黑龙江的特产。果实成熟时外形圆润，色泽金黄，香甜可口，既是芳香甜美的水果，又是营养丰富的补品[1]，深受人们喜爱。然而，毛酸浆在加工过程中，容易发生酶促褐变，影响毛酸浆加工品质及外观品质。研究表明，果蔬酶促褐变是由果蔬内多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）与多酚类物质接触，催化酚类物质转变成醌，而醌又进一步聚合成黑色素所致[2-3]。因此，多酚氧化酶活力是决定果蔬组织褐变程度的重要因素之一，对多酚氧化酶特性的研究就成了解决褐变问题的重点所在。目前，关于果蔬类多酚氧化酶已有广泛研究[4-7]。作者对毛酸浆多酚氧化酶的活性进行研究，并考察不同抑制剂对其PPO的抑制效果，旨在为控制毛酸浆加工过程中酶促褐变提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料毛酸浆：市售。

1.1.2 试剂柠檬酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯二酚、抗坏血酸、L-半胱氨酸、EDTA、亚硫酸氢钠：均为国产分析纯。

1.1.3 仪器ALC-210.2型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司产品；TGL-16G型离心机：上海安亭科学仪器厂产品；201306454型可见分光光度计：上海佑科仪器仪器有限公司产品；DK-S12型电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司产品；PB-10型pH计：Sartorius产品；HC-TP11-10型天平：上海精科天平产品。

1.2 实验方法

1.2.1 毛酸浆PPO的提取称取果肉15.0 g，加入0.05 mol/L pH 7.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液15.0 mL，冰浴下快速研磨至匀浆，低温13 000 r/min离心10 min，取上清液即为毛酸浆PPO粗酶液。

1.2.2 毛酸浆PPO活性的测定取pH 7.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液0.5 mL，0.02 mol/L邻苯二酚2.0 mL，混匀，36℃保温10 min后迅速加入0.5 mL PPO粗酶液，酶液加入后开始计时。以0.5 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液加2.0 mL邻苯二酚加去离子水对照。在420 nm下每隔10 s测一次吸光值，共240 s，重复测3次，以每分钟吸光度改变0.001所需酶量为1个活力单位。酶活力计算公式为：XPPO= U/V

式中：U为酶活力（U）；V为粗酶液体积（mL）。

1.2.3 pH对毛酸浆PPO活性的影响配制pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0系列磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，酶反应液组成和酶活力测定条件同1.2.2，确定PPO作用的最适pH条件。

1.2.4 温度对毛酸浆PPO活性的影响取最适pH条件下磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液0.5 mL和0.02 mol/L邻苯二酚溶液2.0 mL，混匀，分别在30、35、40、45、50、55、60、65、70℃保温10 min，取出后迅速加入0.5 mL酶液，按照1.2.2方法测定相对酶活力，确定PPO作用的最适温度。

1.2.5 毛酸浆PPO的热稳定性取PPO粗酶液0.5 mL与最适pH条件下的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液3.5 mL，混匀，分别在80、90、100℃水浴中分别处理1、2、3、4、5 min后，冷却至室温，按1.2.2方法测定PPO的相对酶活力。

1.2.6 底物浓度对毛酸浆PPO活性的影响分别以浓度为0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mol/L的邻苯二酚作为底物，在最适pH条件下按照1.2.2方法测定PPO的相对酶活力，确定PPO作用的最适底物浓度。根据Linewear-Burk双倒数作图法求得米氏常数Km和最大反应速率Vmax。

1.2.7 抑制剂对毛酸浆PPO活性的影响用最适pH的磷酸盐缓冲溶液配制柠檬酸、抗坏血酸、亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸溶液（质量浓度皆为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/L）、EDTA溶液（0.005、0.01、0.015、0.02、0.025 g/L），依次加入最适pH条件下的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液0.5 mL、最适浓度邻苯二酚溶液1.0 mL、各不同浓度抑制剂0.5 mL和PPO粗酶液0.5 mL，按照1.2.2方法测定PPO相对酶活力。以不加抑制剂所测酶活力为100%，计算PPO相对酶活力。

1.2.8 预煮时间的确定分别称取6份15 g的毛酸浆，1份直接测定PPO活力，其余5份分别投入沸水中预煮1、2、3、4、5 min，冷却后在最适pH值下按照1.2.2方法测定PPO相对酶活力。

1.2.9 数据统计与分析每个实验重复3次，利用Microsoft Excel软件统计分析数据，计算标准偏差并制图。

2 结果与分析

2.1 毛酸浆PPO酶活性的测定

从图1可知，在反应最初30 s内，相对酶活力几乎成线性增长，说明初始阶段PPO反应很快，当反应时间达30 s后，相对酶活力上升缓慢并趋于平稳，反应时间超过30 s后，酶的活性不能由反应进程完全表征出来，因此确定反应时间30 s为最佳。

图1 毛酸浆PPO反应进程曲线Fig.1 Enzymatic reaction curve of PPO from Physalis pubescens L.

2.2 pH值对毛酸浆PPO相对酶活的影响

从图2可知，毛酸浆PPO活性对pH的变化较为敏感，当pH＜7.0时，随pH升高多酚氧化酶的活性逐渐增大，在pH=7.0时毛酸浆PPO表现出最大活性，pH＞7.0时，酶活性随pH的升高又逐渐下降，当pH=8时，毛酸浆PPO相对酶活力较低仅为30.34%。这可能是由于PPO是一种含铜蛋白质，在强酸条件下，酶中的铜离子解离出来使酶失活；在碱性环境中，铜离子以Cu（OH）2形式沉淀出来，使酶蛋白的空间结构发生改变，从而使其活性降低。因此，在加工过程中，可以通过调节pH抑制PPO活性，减轻毛酸浆酶促褐变程度。

图2 pH对毛酸浆PPO活性的影响Fig.2 Effect of pH on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

2.3 温度对毛酸浆PPO相对酶活的影响

从图3可知，毛酸浆PPO活性受温度影响较大，随着温度的增加，毛酸浆PPO相对酶活先增加后降低，在40℃时达到最大值。当温度为30℃时，酶活性为最高活性的67.32%，当温度升至70℃，酶活力性为最高活性的52.83%，相对酶活较低。原因是毛酸浆PPO在最适温度才能被完全激活，而升高温度对酶蛋白结构的完整性和稳定性造成了破坏，从而引起毛酸浆PPO酶活降低。因此，毛酸浆PPO的最适反应温度是40℃。

图3 温度对毛酸浆PPO活性的影响Fig.3 Effect of temperature on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

2.4 毛酸浆PPO的热稳定性

高温可以使蛋白质空间结构改变而发生变性，从而使毛酸浆PPO活性降低，使毛酸浆相关产物褐变程度降低。

从图4可知，毛酸浆PPO经不同高温热处理时，相对酶活力均随热处理时间的延长而下降，且温度越高，热处理对PPO的破坏作用越大。分别在80℃、90℃处理 3 min，PPO相对酶活依次为20.33%、10.67%，而在100℃处理3 min，PPO残留活性为0.67%，表明PPO酶活性已完全丧失。因此，在毛酸浆加工中，可采用100℃热处理3 min的方法来钝化毛酸浆PPO，从而达到抑制褐变的目的。

图4 热处理对毛酸浆PPO活性的影响Fig.4 Effect of heat treatment on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

2.5 底物浓度对毛酸浆PPO活性的影响

由图5可知：当底物浓度为0.02～0.04 mol/L时，酶活增加幅度几乎呈线性关系。当浓度为0.04～0.06 mol/L时，酶活性的变化趋于平缓，在底物浓度为0.06 mol/L时酶活达到最大值。这说明该酶促反应存在一个适宜的底物用量，当底物浓度达到这一适宜值时，再增加底物浓度对酶的活性作用不大，反而浓度太高会使酶活下降。因此底物浓度与PPO活性的关系遵循Michealis-Menten的酶促动力学。根据Line-weaver-Burke方程，以1/［S］为横坐标，1/V为纵坐标作图，如图6所示，拟合直线相关系数达到0.987 3，求得米氏常数Km=0.025 mol/L，最大反应速率Vmax=125 U/min。

图5 底物质量分数对PPO酶反应速度的影响Fig.5 Effect of substrate concentration on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

图6 毛酸浆PPO的Lineweaver-Burk图Fig.6 Lineweaver-Burk plotofenzyme-catalyzed reaction of PPO from Pleurotus eryngii Quel

2.6 抑制剂对毛酸浆PPO相对酶活的影响

2.6.1 抗坏血酸对毛酸浆PPO活性的影响抗坏血酸是强还原剂，主要通过3方面作用：将酚的氧化产物醌还原成酚；与酶分子中的Cu2+螯合，使PPO失活；作为竞争性抑制剂，部分替代果蔬中的酚类物质，自身被PPO氧化[8]对毛酸浆PPO的活性进行抑制，从而抑制褐变。

由图7可知，随着抗坏血酸质量浓度的增加，毛酸浆PPO相对酶活力明显减小，当抗坏血酸质量浓度达到0.04 g/L时，毛酸浆PPO相对酶活力仅为1.37%，表明抗坏血酸可对PPO活力产生显著的抑制作用。

近年来，随基夫赛特炉日处理量不断提升，导致烟化炉处理量增加，进而引发锅炉热负荷增加，其中锅炉入口烟气温度设计值为1200±100℃、最大产气量为40.8t/h，但是实际生产过程中锅炉入口烟气温度达到了1375℃、最大产气量达到了50t/h，温度高会导致以下问题。

图7 抗坏血酸质量浓度对毛酸浆PPO活性的影响Fig.7 Effect of ascorbic acid on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

2.6.2 柠檬酸对毛酸浆PPO活性的影响柠檬酸作为1种螯合剂，其3个羧基对毛酸浆PPO的铜离子有较强的螯合作用，可形成配位体化合物而使毛酸浆PPO酶失活。另外，柠檬酸对反应体系的pH值有调节作用，使之远离毛酸浆PPO最适pH而降低活性。

由图8可知，随着柠檬酸质量浓度的增加，毛酸浆PPO相对酶活力逐渐减小，当柠檬酸质量浓度达0.04 g/L时，毛酸浆PPO相对酶活力为19.33%，质量浓度达0.05g/L时，毛酸浆PPO相对酶活力为17.33%。

图8 柠檬酸对毛酸浆PPO活性的影响Fig.8 Effect of citric acid on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

2.6.3 L-半胱氨酸对毛酸浆PPO活性的影响L-半胱氨酸是组成蛋白质的20种氨基酸之一，无毒、无副作用，不存在食品安全问题，是一种理想的天然抗酶促褐变物质。

由图9可知，随着L-半胱氨酸质量浓度的增大，毛酸浆PPO相对酶活力逐渐降低。L-半胱氨酸浓度达到0.015 g/L时，毛酸浆PPO相对酶活力为32.67%，当L-半胱氨酸质量浓度达到0.025 g/L时，毛酸浆PPO相对酶活力仍为20.43%，表明L-半胱氨酸对毛酸浆PPO酶活力有抑制效果，但抑制效果相对抗坏血酸和柠檬酸较差。

图9 L-半胱氨酸质量浓度对毛酸浆PPO活性的影响Fig.9 Effect of L-Cysteine on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

2.6.4 EDTA对毛酸浆PPO活性的影响EDTA作为一种螯合剂，可以与毛酸浆PPO中铜离子形成配位体化合物而使毛酸浆PPO酶失活。

由图10可知，随着EDTA浓度的浓度的增加，毛酸浆PPO活力缓慢减小，当EDTA质量浓度达到0.04 g/L时，毛酸浆PPO相对酶活力为45.33%，质量浓度达到0.05 g/L时，毛酸浆PPO相对酶活力为42.58%。说明EDTA质量浓度为0.05g/L时护色效果最佳，但相比其他抑制剂，EDTA抑制效果不明显，与张福平[9]等的研究结果也类似。

图10 EDTA对毛酸浆PPO活性的影响Fig.10 Effect of EDTA on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

由图11可知，随着NaHSO3质量浓度的增大PPO活力降低缓慢。当NaHSO3质量浓度达到0.05 g/L时，毛酸浆PPO相对酶活力仍为66.67%，说明NaHSO3对毛酸浆的护色效果远不如其他几种抑制剂。并且由于NaHSO3有漂白作用，可产生不良异味，破坏营养，使组织软化，且有害健康，美国FDA已对其使用作出限制[10]。

图11 NaHSO3对毛酸浆PPO活性的影响Fig.11 Effect of NaHSO3on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

2.7 预煮对毛酸浆PPO相对酶活的影响

热烫预煮的主要目的是杀死微生物和破坏多酚氧化酶酶的活性，防止毛酸浆浊汁在加工过程中变色、变味和营养成分的损失，从而提高产品的保质期[11-12]。

预煮时间对毛酸浆PPO相对酶活力的影响如图12所示，随着加热时间的延长，PPO活性不断降低。100℃加热1 min，毛酸浆PPO相对酶活力降低为9.56%，加热2 min，毛酸浆PPO相对酶活力为0.61%，加热3min毛酸浆PPO相对酶活力降为0.53%。

图12 预煮时间对毛酸浆PPO活性的影响Fig.12 Effect of heat treatment on the activity of PPO from Physalis pubescens L.

3 结语

毛酸浆PPO底物邻苯二酚的最适浓度为0.04 mol/L，最适pH为6.0，最适温度为35℃，在100℃高温条件下热处理3 min，整果在100℃预煮2 min，PPO酶活几乎完全丧失。

动力学研究表明，以邻苯二酚为底物时，底物浓度与毛酸浆 PPO活性的关系遵循 Michealis-Menten的酶促动力学方程，得到米氏常数Km=0.025 mol/L，最大反应速率Vmax=125 U/min。

5种常用的酶活抑制剂对毛酸浆PPO的抑制效果均随着浓度的增大而加强，抑制能力由强到弱依次为：抗坏血酸＞柠檬酸＞L-半胱氨酸＞EDTA＞亚硫酸氢钠，抗坏血酸对毛酸浆PPO活性的抑制效果最好，当浓度达到0.04 mol/L时，PPO活性可完全得到抑制。

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Study on Enzymatic Characteristics of Polyphenol Oxidase from Physalis pubescens L.

GAO Xinxin， WEI Zhen， CHANG Chen， LIU Junkun， WANG Ping*
（College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）

The enzymatic characteristics of polyphenol oxidase（PPO）from Physalis pubes-cens L. was studied by spectrophotometer at 420 nm.The results showed thatthe PPO enzyme had the highest activity at pH 7.0 and 35℃ and the enzyme activity would been inactivated completely after exposure to 100℃for 2 min.The kinetics of enzyme-catalyzed reaction of PPO was in accord with Michaelis-Menten equation，with Kmand Vmax values of 0.025 mol/L and 125 U/min，respectively.In the range designated，it was increasing in inhibitory effects of ascorbic acid，citric acid，NaHSO3，L-Cysteine and EDTA against enzyme activity with the increasing concentration，and the order as follow：ascorbic acid＞citric acid＞L-cysteine＞EDTA＞NaHSO3.

Physalis pubescens L.，polyphenol oxidase（PPO），enzymatic characteristics

Q 554

A

1673—1689（2015）01—0102—06

2014-04-19

国家级大学生创新实验项目（201310225012）。

*通信作者：王 萍（1964—），女，黑龙江伊春人，工学博士，教授，主要从事植物活性物质研究。E-mail：949508700@qq.com