PI3K/Akt信号通路在严重烧伤大鼠血清诱导BMSCs迁移中的作用*

李茂华，滕 苗，果 磊

(重庆医科大学附属第一医院烧伤整形外科 400016)

论著·基础研究

PI3K/Akt信号通路在严重烧伤大鼠血清诱导BMSCs迁移中的作用*

李茂华，滕 苗，果 磊△

(重庆医科大学附属第一医院烧伤整形外科 400016)

目的探讨严重烧伤大鼠血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)迁移的影响及作用机制。方法建立严重烧伤大鼠模型，并制备严重烧伤大鼠血清。实验分为正常培养组(含10%胎牛血清，C组)、烧伤血清组(含10%烧伤大鼠血清，B组)、烧伤血清+阻断剂组(含10%烧伤大鼠血清+终浓度为10 μmol/L的PI3K信号通路抑制剂LY294002，B+LY组)，MTT法检测各组细胞活性；Transwell小室检测各组细胞迁移情况；Western blot检测各组细胞p-Akt、Akt蛋白表达；免疫荧光检测各组细胞微管结构。结果与C组比较，B组烧伤血清处理24 h后，BMSCs细胞活性增高(P<0.01)，p-Akt水平升高(P<0.05)，细胞微管结构出现解聚，迁移数量增高(P<0.001)；加入抑制剂后，与B组比较，B+LY组BMSCs细胞活性降低(P<0.01)，迁移数量降低(P<0.001)，p-Akt水平降低(P<0.05)，细胞微管结构变化不明显。结论严重烧伤大鼠血清可促进BMSCs细胞迁移，可能与烧伤血清中细胞因子激活PI3K/Akt信号通路相关，进而引起BMSCs细胞微管结构变化，促进BMSCs迁移。

烧伤；间质干细胞；微管；迁移；PI3K/Akt；信号通路

严重烧伤有别于一般创伤，损伤组织。以及免疫防御系统可分泌大量炎症介质、细胞因子和烧伤毒素。烧伤后，在毛细血管通透性增加导致全身循环血量下降以前，即可发生心肌缺血缺氧损害和心功能减退，从而诱发或加重烧伤休克，即“休克心现象”[1]，加重多器官损害，是导致患者死亡的主要原因。烧伤后各脏器结构、功能损伤修复，以及烧伤创面的愈合一直是临床救治的难点。

间充质干细胞(MSCs)是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类成体干细胞，其取材简便、来源广泛，具有自我更新、快速增殖及多向分化潜能，且能分泌多种细胞因子，调节微环境，能够向损伤组织迁移，分泌细胞因子减缓全身及局部炎症，减少受损组织细胞的凋亡，促进血管生成，激活内源性干细胞，减轻器官组织功能紊乱，提高动物模型的生存率[2]，为烧伤临床治疗开拓新的治疗方法。研究发现将载有绿色荧光蛋白(GFP)的人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)移植在烧伤小鼠创面，hBMSCs可向血管内皮样细胞分化，促进烧伤创面愈合[3]。但严重烧伤时，损伤组织微环境对MSCs有何种影响，目前尚不明确。吕根法等[4]研究发现烧伤血清作用下的心肌细胞存在PI3K/Akt和p38信号通路的交叉对话，并可能对心肌细胞产生调控作用。PI3K/Akt通路是膜受体信号向细胞内转导的重要途径，可被细胞因子和理化因素激活，具有调控物质代谢、基因表达、细胞迁移、增殖和存活等多种生物学功能。研究发现在BMSCs向胶质瘤的定向迁移过程中，PI3K信号通路发挥了作用[5]。严重烧伤血清能否激活PI3K/Akt通路，促进BMSCs向损伤组织、细胞迁移，进而促进损伤组织修复、创面愈合，目前尚未见文献报道。

本实验拟采用严重烧伤大鼠血清模拟严重烧伤微环境培养BMSCs，观察烧伤血清对BMSCs活性、迁移的影响，探讨PI3K/Akt通路在此过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂及仪器 SD大鼠BMSCs细胞株及BMSCs细胞完全培养基(广州赛业生物科技有限公司)；胎牛血清(FBS，Gibco,USA)；MTT(碧云天生物技术研究所)；α-tubulin单克隆抗体(Proteintech,USA)；β-actin单克隆抗体(Proteintech,USA)；Akt单克隆抗体(Abcam,USA)；p-Akt单克隆抗体(Cell Signaling,USA)；山羊抗兔IgG二抗(Proteintech,USA)；FITC标记荧光二抗(Proteintech,USA)；LY294002(Santa Cruz,USA)；HEPA Class 100型CO2孵箱(Thermo，USA)；M88自动酶标仪(Thermo，USA)；Fusion FX7凝胶成像分析系统(VILBER lour MAT，French)，激光共聚焦(LSM 510 META，Germany)。

1.2 方法

1.2.1 严重烧伤大鼠血清的制备 取体质量200～280 g 的雄性SD 大鼠30 只(第三军医大学实验动物中心提供)，参考文献[6]，制成40%TBSA的Ⅲ度烫伤模型。伤后 6 h在无菌操作下抽取腹主动脉血，室温凝血，4 ℃过夜，使血凝块尽量收缩。吸出血清，4 ℃ 3 000 r/min离心15 min，取上清液，56 ℃加热30 min 以灭活补体。上清液分装，-20 ℃冻存备用。

1.2.2 实验分组 取第3代生长状态良好BMSCs，实验随机分为：正常培养组(C组)、烧伤血清组(B组)、烧伤血清+阻断剂组(B+LY组)，待细胞融合达80%～90%时，加入无血清BMSCs细胞基础培养基饥饿同化24 h，C组加入含10%胎牛血清(FBS)的BMSCs培养基，B组加入含10%烧伤大鼠血清的BMSCs培养基，B+LY组加入抑制终浓度为10 μmol/L的PI3K信号通路抑制剂LY294002+含10%烧伤大鼠血清的BMSCs培养基，作用24 h后进行相应检测。

1.2.3 MTT法检测BMSCs细胞活性 按1.2.2分组处理细胞，以2×105个/200 μL接种于96孔板，每组6个复孔，24 h后吸去培养液，PBS洗涤2次，每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL，继续培养4 h，弃上清液，加入150 μL甲基亚砜(DMSO)振荡10 min，用自动酶标仪在570 nm处测定吸光值(A)，本实验重复3次。

1.2.4 Transwell小室检测细胞迁移 按1.2.2分组处理细胞，调整细胞浓度为4×104个/400 μL接种于Transwell小室上室中，C组Transwell小室下室加入600 μL含10%FBS的BMSCs细胞培养基，B组下室内加入600 μL含10%烧伤大鼠血清的BMSCs细胞培养基，B+LY组在Transwell上室加入抑制终浓度为10 μmol/L的PI3K信号通路抑制剂LY294002，下室内加入600 μL含10%烧伤大鼠血清的BMSCs细胞培养基，放入 37 ℃、5% CO2培养箱继续培养。24 h后取出Transwell小室，将上室培养基吸尽，用棉签擦拭上室中的细胞，PBS清洗1次，并将小室置于4%多聚甲醛中室温固定20 min，PBS清洗1次，结晶紫染色30 min，PBS清洗，显微镜下观察小室半透膜下表面细胞并计数，每组按照上下左右中随机选取5个视野，取5个视野细胞总数的均数进行统计分析，以迁移至小室半透膜下表面细胞个数的均数表示细胞的迁移能力。

1.2.5 Western blot检测Akt、p-Akt蛋白的表达 按1.2.2分组处理细胞，收集细胞进行离心沉淀，按总蛋白提取试剂盒说明书提供的方法提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取40 μg/孔蛋白进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，5%BSA室温封闭2 h，分别加入Akt(1∶500)、p-Akt(1∶500)抗体，4 ℃过夜；次日，TBST洗膜3次，加入1∶4 000稀释的HRP标记的山羊抗兔二抗，37 ℃孵育2 h，化学发光、显影，凝胶成像仪获取图像，Image J 软件进行灰度分析，结果以p-Akt与Akt灰度值比值表示。本实验重复3次。

1.2.6 免疫荧光染色观察细胞微管结构 按1.2.2分组处理细胞，以1×103个/mL密度接种于无菌玻片的24孔板中，24 h后，用4%的多聚甲醛室温固定细胞爬片30 min，0.1% Triton X-100破膜20 min，5%山羊血清37 ℃封闭30 min，滴加兔抗大鼠的α-tubulin单克隆抗体(1∶100)，4 ℃过夜；滴加荧光二抗(1∶100)，37 ℃避光孵育1 h，滴加DAPI(1∶100)，37 ℃避光孵育5 min，抗荧光淬灭剂封片，每步操作前均要用PBS洗3遍，每遍5 min，但血清封闭后不洗，直接加一抗。激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

2 结 果

2.1 MTT法检测BMSCs活性 C组、B组、B+LY组细胞活性分别为1.76±0.09、1.93±0.06、1.57±0.2(F=9.10，P<0.01)。与C组比较，B组细胞增多，活性增高(t=3.50，P<0.01)；加入抑制剂后，B+LY组细胞活性较B组降低(t=3.80，P<0.01)。

A：C组；B：B组；C:B+LY组。

图1 3组BMSCs细胞迁移情况(×100)

2.2 Transwell小室检测细胞迁移 与C组比较，B组每100倍视野下迁移至小室半透膜下表面的细胞增多(t=7.14，P<0.01)，B+LY组迁移至小室半透膜下表面的细胞数量较B组明显减少(t=9.13，P<0.01)。见图1、表1。

表1 3组BMSCs细胞迁移数比较个)

2.3 Western blot检测Akt、p-Akt蛋白的表达 24 h后，各组p-Akt/Akt比值分别为0.42±0.04、0.95±0.02、0.63±0.02，B组细胞Akt磷酸化水平较C组增高(t=20.29,P<0.01)，加入抑制剂后，B+LY组细胞Akt磷酸化水平较B组降低(t=16.68,P<0.01)，见图2。

2.4 免疫荧光染色观察细胞微管结构 C组细胞微管以胞核为中心向四周呈放射状分布，B组细胞微管出现解裂增多，排列紊乱，B+LY组微管结构与C组相似，见图3。

a：P<0.05,与C组比较;b:P<0.05，与B+LY组比较。

图2 3组BMSCs细胞Akt活化状态

A：C组；B：B组；C:B+LY组。

图3 3组BMSCs细胞微管的分布及形态变化

3 讨 论

严重烧伤后引起的脏器损害和功能下降，特别是烧伤合并多器官功能障碍综合征，是导致患者死亡的主要原因，烧伤后各脏器结构和功能损伤的确切机制仍不完全明了，严重烧伤一直是困扰医学界的难题。近年，干细胞与组织工程学的飞速发展，为大面积烧(创)伤的修复开辟了新的途径。目前已有研究表明MSCs可促进烧伤创面愈合，胡克苏等[7]将人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)移植修复烧伤皮肤，研究发现UC-MSCs移植治疗可能通过抑制皮损局部炎性反应，减少淋巴细胞的浸润，促进血管的再生和成纤维细胞的生长促进损伤皮肤的修复。此外，研究将BMSCs移植到严重烧伤大鼠体内，研究发现移植后BMSCs能够向受损肝组织定植，对烧伤引起的肝损伤有明显的修复作用，其机制可能与抑制细胞凋亡有关[8]。MSCs移植后，其定向迁移至受损部位是其发挥作用的前提，损伤组织分泌细胞黏附因子、趋化因子和生长因子等相互调节，可影响MSCs的黏附、迁移。烧伤后患者血清中含有集落刺激因子、转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)等。严重烧伤患者血清可显著刺激人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)快速增殖，不引起细胞凋亡，能减少细胞衰老[9]。但严重烧伤血清能否促进MSCs迁移尚不清楚。

PI3K/Akt信号通路最早被发现在胰岛素刺激及其应答的调控中起重要作用。随着研究的深入和下游底物的不断发现，PI3K/Akt信号通路作为一条非常重要的细胞内信号转导通路被人们所认识。Akt是PI3K信号通路的直接下游效应分子，PI3K可被PDGF、IGF、胰岛素、成纤维生长因子(FGF)、重组人EGF、骨形态发生蛋白2(BMP-2)等细胞因子与其受体结合而激活，活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad[10]、mTOR[11]、Caspase9、NF-κB、GSK-3、FKHR、p21Cip1和p27 Kip1等，进而调节细胞的增殖、分化、凋亡，以及迁移等[12]。研究发现，用PI3K/Akt抑制剂LY294002和Wortmannin可减弱SDF-1α和bFGF诱导的MSCs迁移[13-14]。

本实验以严重烧伤血清处理BMSCs模拟体内严重烧伤环境，实验结果表明，烧伤血清处理24 h后，BMSCs细胞活力、细胞迁移数量较正常培养组增高，且p-Akt水平增高，表明严重烧伤血清可促进BMSCs细胞迁移，且可激活PI3K/Akt信号通路。为进一步证实烧伤血清诱导PI3K/Akt信号通路活化是否参与BMSCs细胞的迁移，加入PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002后，BMSCs细胞迁移能力明显受抑，表明严重烧伤血清可促进BMSCs细胞迁移，可能与其激活PI3K/Akt信号通路相关。此外，本实验还发现严重烧伤血清处理BMSCs后，BMSCs细胞微管结构解聚/聚合动态失衡，发生解聚，同时细胞迁移能力增强，但用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002作用后BMSCs细胞微管结构与正常培养组相似，且细胞迁移能力减弱，说明严重烧伤血清可能激活BMSCs细胞PI3K/Akt信号通路，进而影响细胞微管结构发生变化，使细胞骨架解聚/聚合的动态平衡被打破，朝解聚方向移动，以利于细胞迁移。

有研究表明，细胞迁移需要微管介导的细胞体的收缩、伸展等一系列过程，缺氧可使表皮细胞微管动力学发生变化，增强细胞迁移能力[15]。PI3K/Akt信号通路可影响许多细胞结构，特别是肿瘤细胞。核糖体蛋白S6激酶[p70(S6K)]是PI3K/Akt信号通路下游信号分子，p70(S6K)可通过肌动蛋白纤维交联蛋白调节细胞骨架动力学。过表达p70(S6K)可促进卵巢癌细胞定向迁移[16]。p70(S6K)可快速激活Ras相关的C3肉毒素底物1、细胞分裂周期蛋白42以及他们下游信号分子p21小GTP酶活化激酶1[16]。抑制p70(S6K)可导致其下游蛋白表达下调及肌动蛋白骨架结构重组。但在严重烧伤环境下，严重烧伤血清中哪些物质激活PI3K/Akt信号通路，通过调控细胞微管骨架结构变化，进而促进细胞迁移能力的具体作用机制还有待进一步研究。

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Role of PI3K/Akt signal pathway in BMSCs migration induced by serum of rats with severely burn*

LiMaohua，TengMiao，GuoLei△

(DepartmentofBurnandPlasticSurgery，theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016,China.)

ObjectiveTo study the effects of severely burned rats serum on migration of BMSCs and mechanism.MethodsSeverely burned rats model was established，and the preparation of severely burned rats serum.Experimental groups:normal training group(containing 10% fetal bovine serum，group C)，burn serum group(containing 10% burns in the rat serum，group B)，burn serum+blockers(10% burns in the rat serum+final concentration of 10 μmol/L PI3K signaling pathway inhibitor LY294002 training，group B+LY).Activity of cells was examined with MTT;migration of cells was examined with Transwell chambers testing;protein expression of p-AKT/AKT was determined with Western blot;microtubule structure of cells was examined with immunofluorescence.ResultsCompared with group C，group B burn serum treatment after 24 h，BMSCs activity(P<0.01)，p-AKT levels(P<0.05),increased migration quantity(P<0.001);cell microtubule structures appear rupture，after adding inhibitor，compared with group B，group B+LY BMSCs activity(P<0.01)，to reduce the number of migration(P<0.001)，p-lower AKT(P<0.05)，cell microtubule structure similar to the normal group.ConclusionSeverely burned rats serum can promote BMSCs migration，may burn serum cytokine activation of PI3K/AKT signal pathway，resulting in cell microtubule structure change，promote the migration of BMSCs.

burns；mesenchymal stem cells；microtubules；migration；PI3K/Akt；signaling pathway

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.27.003

重庆市基础与前沿研究计划项目(cstc2013jcyjA10069)

：李茂华(1989-),硕士，研究方向为创面愈合与瘢痕防治。△

，E-mail:cqguolei@sina.com。

R34

A

1671-8348(2015)27-3752-04

2015-03-07

2015-06-13)