携带小鼠信号转导子及转录激活子3重组慢病毒载体的构建与鉴定*

杨华安，张 扬，杨钰兴， 胡 溯，苟 欣

(1.重庆市渝北区人民医院泌尿外科 401120 ；2.重庆医科大学附属第一医院泌尿外科 400016)

·技术与方法·

携带小鼠信号转导子及转录激活子3重组慢病毒载体的构建与鉴定*

杨华安1，张 扬1，杨钰兴1， 胡 溯1，苟 欣2△

(1.重庆市渝北区人民医院泌尿外科 401120 ；2.重庆医科大学附属第一医院泌尿外科 400016)

目的构建携带小鼠信号转导子及转录激活子3(STAT3)的重组慢病毒载体，并检测STAT3的蛋白表达，进行慢病毒包装并鉴定。方法将小鼠成肌细胞总RNA通过STAT3引物逆转录为cDNA PCR扩增、回收后，同pLVX -IRES-ZsGreen1载体片段连接，酶切鉴定及测序，将pLVX -IRES-ZsGreen1-STAT3转染293 T细胞，48 h 后收集细胞,Western blot检测STAT3表达量，通过瞬时转染法包装出病毒上清。结果测序结果证实STAT3成功插入pLVX -IRES-ZsGreen1慢病毒载体，成功构建了慢病毒载体pLVX -IRES-ZsGreen1-STAT3,共转染293 T细胞48 h,Western blot检测STAT3表达量明显增强。测定病毒滴度为8.4×107TU/mL。结论成功构建了STAT3基因的重组慢病毒表达载体,为进一步应用奠定了基础。

信号转导子及转录激活子3；慢病毒载体

信号转导子及转录激活子3(STAT3)是多种细胞因子及生长因子的信号传导因子，具有促进增殖、抑制凋亡，特别是促进肿瘤免疫抑制微环境形成等多种作用[1]，提示其在树突状细胞致免疫耐受的形成中起相关作用。本研究拟携带小鼠STAT3重组慢病毒载体，观察其蛋白表达情况，进行慢病毒包装，测定病毒滴度，为后续实验打下基础。

1 材料与方法

1.1 试剂 TRIzol(ambion)；DNA凝胶回收试剂盒(东盛生物)；M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen)；T4 DNA Ligase(Invitrogen)、2×PFU PCR MasterMix(Tiangen)；XhoⅠ、BamH Ⅰ限制性内切酶(New England Biolabs)；pLVX-IRES-ZsGreen1载体及病毒包装及检测系统(Clontech)；引物均由Invitrogen公司合成。DMEM培养基(Gibco);FBS(Gibco,原产地澳洲)；0.25%胰酶(1x，Gibco)；DNA Transfection reagent(转染试剂，Roche)；Opti-MEM培养基(Gibco)。anti-STAT3抗体(Abcam)； anti-GAPDH 抗体(CST)、anti-Rabbit二抗(CST)；Super ECL检测试剂盒(KeyGEN)。

1.2 方法

1.2.1 pLVX-IRES-ZsGreen1-STAT3构建 收集培养小鼠成肌细胞，抽提总RNA,逆转录成cDNA，Stat3 上游引物:5′-CCG CTC GAG ATG GCT CAG TGG AAC CAG CT-3′，下游引物:5′-CGC GGA TCC TCA CAT GGG GGA GGT AGC A-3′，PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min×30个循环；72 ℃ 5 min。电泳切胶回收DNA片段，XhoⅠ和BamH Ⅰ双酶切同pLVX -IRES-ZsGreen1载体片段连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α于37 ℃培养16 h。取单菌落菌液PCR鉴定，并扩增菌液，小量快速抽提质粒DNA，酶切鉴定、电泳，并测序分析。

1.2.2 转染重组载体pLVX-IRES-ZsGreen1-STAT3后293 T细胞STAT3蛋白的表达 设置空载体对照，转染48 h后收集细胞,提取蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行电泳。用GAPDH作内参，抗体滴度参照抗体说明书。 ECL化学发光显影。STAT3蛋白表达强度的计算:表达强度=STAT3条带灰度/GAPDH条带灰度。

1.2.3 慢病毒载体的包装 共转染293 T细胞及分组接种293 T细胞，每个T 75细胞培养瓶9×106～10×106个细胞，次日观察细胞密度，达80%～90% 即可用pLVX-IRES-ZsGreenl-STAT3重组慢病毒载体包装系统共转染293 T细胞。该慢病毒载体的3种质粒成分psPAX2、pMD2G和Plvx-IRES-ZsGreenl 20 μg，浓度比例为1∶1∶2。转染24 h和48 h后收集病毒上清以0.45 μm滤器过滤，于40 mL超速离心管中，4 ℃、72 000×g离心120 min；500 μL PBS重悬病毒沉淀，置于4 ℃冰箱保存。同时将空质粒共转293 T细胞，并收集上清。

1.2.4 滴度测定 滴度检测前1 d，选取生长状态良好的293 T细胞铺96孔板，每个孔加入总体积100 μL 约 5×103个细胞； 第2天，准备好无菌 EP 管，取待测定的病毒原液 10 μL 加入到第1个管中，轻轻混匀后，用含10%FBS的1640培养基倍比稀释病毒液； 选取所需的细胞孔，每孔加入10 μL 稀释好的病毒液，放入 37 ℃ 5% CO2培养箱中培养；36～48 h后，每孔加入 100 μL 新鲜培养液，小心操作，不要吹起细胞； 3 d后，观察293 T细胞荧光表达情况，并计数带荧光的细胞将得到的数值除以稀释倍数，即可计算出病毒原液的滴度值。病毒滴度(BT=TU/mL)计算公式： TU/μL=阳性细胞数×V×稀释倍数；V=每孔加入病毒稀释液体积(μL)，TU/mL=TU/μL×1 000。

1.3 统计学处理 使用SPSS10.0统计分析软件进行数据分析,两组间比较使用t检验,组间多重比较使用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 STAT3基因的鉴定 根据GenBank的STAT3基因编码区(CDS)设计相应引物，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离检测，可见2 370 bp的特异条带，与理论值一致。见图1。

M：标记物；1～3：条带。

图1 STAT3 PCR 酶切鉴定图

2.2 质粒测序 进一步质粒测序鉴定结果显示，目的片段插入方向正确，所测序列与GenBank中STAT3基因序列比较无差异。部分测序结果见图2。

2.3 Western blot检测转染48 h后293 T细胞中STAT3的表达 转染48 h后,与转染空载体重组质粒的293 T细胞相比,pLVX-IRES-ZsGreen1-STAT3重组质粒转染的293 T细胞,STAT3的总蛋白水平显著增加。见图3。

2.4 荧光显微镜观察结果 3质粒共同转染293 T细胞观察及病毒滴度测定转染后48 h，荧光显微镜观察可见大量绿色荧光(图4)，提示转染成功。经计算，病毒滴度为8.4×107TU/mL。

图2 STAT3 mRNA部分测序图

NC:空载体对照组；STAT1及STAT2：pLVX -IRES-ZsGreen1-STAT3重组质粒组。

图3 Western blot检测

图4 293 T细胞荧光图微观察结果

3 讨 论

树突状细胞是高特异性的抗原呈递细胞，它收集各种输入信号，介导免疫反应；同时在自身免疫性疾病或移植耐受研究中起重要作用。目前研究表明树突状细胞的激活对T细胞反应起决定性作用，在无感染和相关“危险”信号刺激下,未成熟树突状细胞低水平、稳态地进入淋巴组织，这些静态树突状细胞帮助维持外周免疫耐受[2]。肿瘤“逃逸”的机制之一是使免疫系统的未成熟树突状细胞数量增加，这类未成熟树突状细胞在患者体内不能转分化为成熟状态，而诱导耐受[3-4]。

正常细胞中STAT3在增殖、分化、凋亡等生理过程中起重要作用，正常细胞中STAT3磷酸化过程很短暂，而在许多肿瘤组织以及细胞系中可以见到STAT3分子持续活化[5]，有利于免疫抑制微环境形成，诱导树突状细胞的免疫耐受[6],而通过RNA干扰细胞的STAT3表达，能明显增强树突状细胞的免疫活性[7]。最近研究人员发现多种自身免疫性疾病同STAT3基因突变相关[8]。而Hp细胞毒素相关基因能通过IL-10激活STAT3信号通路抑制树突状细胞的成熟及功能[9]。因此，STAT3可能同树突状细胞的分化密切相关[10]。

通过慢病毒载体，将STAT3基因(目的基因)和GFP基因(报告基因)通过IRES(核糖体内部进入序列)连接并转入到慢病毒主体质粒中，载体中的IRES可以使STAT3和GFP分别在细胞内表达。将重组载体转染293 T细胞验证了STAT3插入载体后，Western blot实验发现转染后的293 T细胞STAT3表达明显强化，表明其蛋白表达的正确及有效表达。载体质粒及包装质粒共转染293 T细胞48 h后通过荧光显微镜观察到大量绿色荧光，说明包装产毒成功。病毒滴度测定结果显示，获得的病毒滴度达到8.4×107TU/mL。本实验成功构建了STAT3和GFP基因共表达的高滴度慢病毒载体，为后继实验打下基础。

[1]Huang SY．Regulation of metastases by signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathway：clinical implications[J]．Clin Cancer Res,2007,13(5):1362-1366.

[2]Shortman K,Liu YJ.Mouse and human dendritic cell subtypes[J].Nat Rev Immunol,2002,2(3):151-161.

[3]de Visser KE,Eichten A,Coussens LM.Paradoxical roles of the immune system during cancer development[J].Nat Rev Cancer,2006,6(1):24-37.

[4]da Cunha A,Michelin MA,Murta EF.Pattern response of dendritic cells in the tumor microenvironment and breast cancer[J].World J Clin Oncol,2014,5(3):495-502.

[5]Masciocchi D,Gelain A,Villa S,et al.Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3):a promising target for anticancer therapy[J].Future Med Chem,2011,3(5):567-597.

[6]See AP,Han JE,Phallen J,et al.The role of STAT3 activation in modulating the immune microenvironment of GBM[J].J Neurooncol,2012,110(3):359-368.

[7]Brady MT,Miller A,Sait SN,et al.Down-regulation of signal transducer and activator of transcription 3 improves human acute myeloid leukemia-derived dendritic cell function[J].Leuk Res,2013,37(7):822-828.

[8]Flanagan SE,Haapaniemi E,Russell MA,et al.Activating germline mutations in STAT3 cause early-onset multi-organ autoimmune disease[J].Nat Genet,2014,46(8):812-814.

[9]Kaebisch R,Mejías-Luque R,Prinz C,et al.Helicobacter pylori cytotoxin-associated gene A impairs human dendritic cell maturation and function through IL-10-mediated activation of STAT3[J].J Immunol,2014,192(1):316-323.

[10]Masciocchi D,Gelain A,Villa S,et al.Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3):a promising target for anticancer therapy[J].Future Med Chem,2011,3(5):567-597.

Construction and identification of a recombinant lentivirus harboring expressing Mus musculus STAT3 gene*

YangHuaan1，ZhangYang1，YangYuxin1，Husuo1，GouXin2△

(1.DepartmentofUrologicalSurgery,YubeiDistrictPeople′sHospital,Chongqing401120，China; 2.DepartmentofUrologicalSurgery，FirstAffiliatedHospital，ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China)

ObjectiveTo construct recombinant lentivirus with the gene STAT3 of the Mus musculus,measure the expression of STAT3，and conduct lentivirus packing and identification.MethodsThe mRNA of mouse myoblast was extracted and transformed into STAT3 cDNA by the special primer.then,STAT3 cDNA was amplified and reclaimed and inseted into pLVX -IRES-ZsGreen1 vector.Cleavage map and sequencing analysis were used for identification of the recombinant lentivirus vector(pLVX -IRES-ZsGreen1-STAT3).293 T cells were transfected with main vector pLVX -IRES-ZsGreen1-STAT3.and 48 h later,Western blott detected the expression of STAT3 protein.Lentiviral vectors were packaged and the titer was determined.ResultsThe lentiviral vector plasmid pLVX -IRES-ZsGreen1-STAT3 was identified correctly by cleavage map and Co-transfection of 293 T cells with 48 h,the expression of STAT3 was significantly enhanced by western blot.And DNA sequencing analysis confirmed that STAT3 gene sequencing was exactly the same with that reported by genbank．Conclusion Lentiviral vector carrying STAT3 was successfnlly constructed and could express STAT3 with high efficiency,and can be used in further study.

signal transducers and activators of transcription 3;lentivirus vector

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.27.018

重庆市科委自然科学基金资助项目(2012JJA10002)；重庆市卫生局基金资助项目(20122296)。

：杨华安(1981-)，硕士，主治医师，研究方向为肾移植及膀胱肿瘤。△

，E-mail：cymnk@163．com。

R392.4

A

1671-8348(2015)27-3803-02

2015-04-15

2015-06-20)